豬瘟活疫苗(傳代細胞源)免疫產生期和免疫持續期試驗

任向陽 , 吳文福 , 岑小清，游啟有 , 劉秋燕，賴月輝，黃秋雪

(1.廣東永順生物制藥股份有限公司，廣東廣州511356 ； 2.廣州出入境檢驗檢疫局，廣東廣州510623)

豬瘟活疫苗(傳代細胞源)免疫產生期和免疫持續期試驗

任向陽1，2, 吳文福1, 岑小清1，游啟有1, 劉秋燕1，賴月輝1，黃秋雪1

(1.廣東永順生物制藥股份有限公司，廣東廣州511356 ； 2.廣州出入境檢驗檢疫局，廣東廣州510623)

將三批豬瘟活疫苗(傳代細胞源)以單劑量分別接種仔豬進行免疫產生期試驗。在免疫同時以及免后1、2、3、4、5日連同對照組分別攻擊豬瘟強毒，攻毒后觀察16天，結果表明，豬瘟活疫苗(傳代細胞源)免后4日即可產生堅強的免疫保護力。將三批豬瘟活疫苗(傳代細胞源)以單劑量分別接種仔豬進行免疫持續期試驗。在免后3個月、6個月、9個月、12個月、15個月連同對照組分別攻擊豬瘟強毒，攻毒后觀察16天，結果表明，豬瘟活疫苗(傳代細胞源)的免疫持續期可長達15個月。

豬瘟活疫苗(傳代細胞源) ； 免疫產生期 ； 免疫持續期

豬瘟是一種急性、熱性和高度接觸傳染的病毒性傳染病。其特征為發病急、高熱稽留和細小血管變性，引發全身泛發型小點出血，脾梗死。急性豬瘟由強毒引起，發病率和死亡率較高；弱毒感染不表現臨床癥狀則可能不被覺察。不同品種、性別、年齡的豬均易感，豬瘟嚴重危害我國養豬業并造成巨大的經濟損失。免疫接種是預防和控制該病流行和發生的主要措施。豬瘟疫苗的質量好壞，直接影響豬瘟的免疫效果。利用牛睪丸細胞和兔脾淋組織生產的豬瘟活疫苗病毒含量低，制造工藝落后，效價標準低，在當前疫病復雜等因素影響下很難達到理想的免疫效果。利用豬睪丸傳代細胞系生產的豬瘟活疫苗(傳代細胞源)在生產工藝、病毒含量、純凈性和質量穩定性等方面獲得重大突破[1-3]。本試驗對豬瘟活疫苗(傳代細胞源)的免疫產生期和免疫持續期進行研究，現將試驗方法和結果報告如下。

1 材料

1.1 試驗用疫苗 豬瘟活疫苗(傳代細胞源)三批，分別記錄為：疫苗1、疫苗2、疫苗3。由廣東永順生物制藥股份有限公司生產，并按照《豬瘟活疫苗(傳代細胞源)質量標準》中檢驗方法進行檢驗，所有檢驗結果均合格。

1.2 試驗用仔豬 來源于廣東永順生物制藥股份有限公司實驗動物場自繁自養的CSFV、PRV、PRRSV、PCV2、PPV抗原陰性、未接種過CSF疫苗的二元雜交仔豬。經豬瘟病毒中和試驗方法[8]檢測，選擇豬瘟病毒中和抗體陰性的健康易感豬(25～30日齡)。

1.3 攻毒用強毒 豬瘟強毒石門系血毒，由廣東永順生物制藥股份有限公司制備、鑒定和保存。

1.4 豬瘟病毒抗體ELISA檢測試劑盒(阻斷ELISA) 購自IDEXX公司。

2 方法

2.1 免疫產生期試驗

2.1.1 仔豬的篩選與分組 經豬瘟病毒中和試驗方法篩選豬瘟病毒中和抗體陰性的25～30日齡仔豬，無論是否同窩，均需逐頭檢測。選取95頭豬瘟病毒中和抗體陰性仔豬。隨機分為19組，其中18組為免疫組，每組5頭共90頭；另外1組為對照組5頭。

2.1.2 免疫攻毒 將3批豬瘟活疫苗(傳代細胞源)按標簽注明頭份分別稀釋成1頭份/mL，耳后頸部肌肉注射，每頭注射1.0 mL。做好標記，分開飼養。免疫同時以及免后1、2、3、4、5日(即攻毒同時以及攻毒前1、2、3、4、5日免疫)連同5頭條件相同的非免疫對照仔豬分別攻擊豬瘟強毒，耳后頸部肌肉注射，每頭注射豬瘟強毒石門系血毒1.0 mL(105MLD/mL)。攻毒后每天觀察臨床癥狀，每天上、下午各測體溫1次，連續觀察16日，并統計分析攻毒結果。免疫產生期試驗分組情況見表1。

表1 3批豬瘟活疫苗(傳代細胞源)免疫產生期試驗分組

2.1.3 豬瘟病毒抗體水平的監測 將各試驗組分別于免疫前和攻毒前抽取血樣，分離血清，以阻斷ELISA方法測定其豬瘟病毒抗體水平，分析試驗組在不同時期免疫攻毒保護試驗中的抗體水平。豬瘟病毒抗體檢測操作方法和判定標準按照IDEXX-ELISA試劑盒使用說明書進行。

2.2 免疫持續期試驗

2.2.1 仔豬的篩選與分組 經豬瘟病毒中和試驗方法篩選豬瘟病毒中和抗體陰性的25～30日齡仔豬，無論是否同窩，均需逐頭檢測。選取100頭豬瘟病毒中和抗體陰性仔豬。隨機分為20組，其中15組為免疫組，每組5頭共75頭；另外5組為對照組，每組5頭共25頭。

2.2.2 免疫攻毒 將3批豬瘟活疫苗(傳代細胞源)按標簽注明頭份分別稀釋成1頭份/mL，每批疫苗分別注射25頭仔豬，耳后頸部肌肉注射，每頭注射1.0 mL。做好標記，分開飼養。免疫后3、6、9、12、15個月于每批疫苗的免疫組中隨機抽取5頭，連同5頭條件相同的非免疫對照仔豬分別攻擊豬瘟強毒，耳后頸部肌肉注射，每頭注射豬瘟強毒石門系血毒1.0ml(105MLD/mL)。攻毒后每天觀察臨床癥狀，每天上、下午各測體溫1次，連續觀察16天，并統計分析攻毒結果。免疫持續期試驗分組情況見表2。

表2 3批豬瘟活疫苗(傳代細胞源)免疫持續期試驗分組

2.2.3 豬瘟病毒抗體水平的監測 分別在免前和免后3、6、9、12、15個月進行豬瘟病毒抗體檢測。抽取血樣，分離血清，以阻斷ELISA方法測定其豬瘟病毒抗體水平，分析試驗組在不同時期的抗體水平。豬瘟病毒抗體檢測操作方法和判定標準按照IDEXX-ELISA試劑盒使用書進行。

3 結果與分析

3.1 免疫產生期試驗結果

3.1.1 免疫攻毒試驗結果 將三批豬瘟活疫苗(傳代細胞源)以單劑量免疫仔豬進行免疫產生期試驗，試驗結果見表3。根據試驗結果可知，3批豬瘟活疫苗(傳代細胞源)免疫同時以及免后1日、2日攻擊豬瘟強毒的仔豬均出現典型的豬瘟臨床癥狀；免后3日對仔豬的保護率為60%～80% (3/5～4/5)，免后4日、5日攻擊豬瘟強毒的仔豬既無體溫升高，也無豬瘟臨床癥狀，全部健活。對照豬全部發病，均呈典型的豬瘟臨床癥狀，在觀察16日內有3頭死亡，剖檢可見豬瘟特征性病變。

3.1.2 豬瘟病毒抗體水平的監測結果 各試驗組和對照組分別于免前和攻毒前均抽取血樣，分離血清，以阻斷ELISA方法測定其豬瘟病毒抗體水平，試驗結果顯示，各組的樣品阻斷率均不大于30%，判斷為陰性(無豬瘟病毒抗體存在)。

表3 3批豬瘟活疫苗(傳代細胞源)免疫產生期試驗結果

3.2 免疫持續期試驗結果

3.2.1 免疫攻毒試驗結果 將3批豬瘟活疫苗(傳代細胞源)以單劑量免疫仔豬進行免疫持續期試驗，豬只接種后觀察14日，接種部位均無腫塊出現，未見任何不良反應。免疫持續期試驗結果見表4。根據試驗結果可知，3批豬瘟活疫苗(傳代細胞源)免后3、6、9、12、15個月分別攻擊豬瘟強毒對豬的保護率均為100%(5/5)。對照豬全部發病，均呈典型的豬瘟臨床癥狀，且每組對照組均有3頭以上死亡，剖檢可見豬瘟特征性病變。

表4 3批豬瘟活疫苗(傳代細胞源)免疫持續期試驗結果

3.2.2 豬瘟病毒抗體水平的監測結果 分別在免前和免后3、6、9、12、15個月進行豬瘟病毒抗體檢測。試驗結果見圖1。根據試驗結果可知，三批豬瘟活疫苗(傳代細胞源)以單劑量免疫仔豬，至免疫后15個月，仍維持在理想的水平。

血清抗體變化圖

圖1 3批豬瘟活疫苗(傳代細胞源)免后不同時期的豬瘟抗體水平(抗體平均值)

4 結論

4.1 豬瘟活疫苗(傳代細胞源)免疫接種屬于人工主動免疫。疫苗免疫之后動物機體需要一定的時間來進行抗原的識別和遞呈，動物機體免疫系統受到抗原刺激后則產生體液免疫和細胞免疫應答從而保護動物免受疫病干擾。從疫苗免疫到獲得堅強保護力的時間為非免疫保護期，即為免疫空白期，免疫空白期在任何動物上都不可避免，但免疫空白期越短動物越安全，反之越危險[4]。從豬瘟活疫苗(傳代細胞源)的免疫產生期試驗結果可知，豬瘟活疫苗(傳代細胞源)免疫4日后即可產生堅強的免疫保護力，證明豬瘟兔化弱毒株是非常優秀的疫苗株，盡管如此免疫后2日內依然無法抵抗豬瘟野毒的感染導致發病或死亡，免疫后3日只能提供部分保護，說明豬瘟活疫苗免后存在2～3日的免疫空白期，在此期間要特別注意豬群免受豬瘟野毒感染；免前至免后5日各試驗組和對照組的豬瘟病毒抗體監測結果均為陰性，但免后4日和免后5日免疫豬對豬瘟強毒已經產生堅強的保護力，說明體液免疫相對細胞免疫出現較晚，在免疫初期細胞免疫發揮了重要作用。

4.2 從豬瘟活疫苗(傳代細胞源)的免疫持續期試驗結果可知，至免疫后15個月，豬瘟活疫苗(傳代細胞源)的免疫保護率仍為100%(5/5)。根據豬瘟病毒抗體監測結果可知，豬瘟體液免疫應答相對細胞免疫應答出現較晚，但豬瘟體液免疫應答出現后則維持時間較長，免疫后15個月豬瘟病毒抗體仍維持在理想水平。從豬瘟強毒攻擊后的免疫保護率和豬瘟病毒抗體的變化規律兩方面綜合判斷，免后15個月，豬瘟活疫苗(傳代細胞源)對豬仍可提供堅強的保護力，免疫效果確切。

4.3 在實驗室條件下，斷奶后無母源抗體的仔豬，注射豬瘟活疫苗(傳代細胞源)1頭份可為豬提供15個月的免疫保護。但在豬場實際使用中會遇到如豬瘟母源抗體干擾、其他病原混合感染等諸多問題[5]。因此，在生產實際中可進行兩次免疫，仔豬可于出生后25～35日齡和60日齡左右各注射1次，1頭份/頭，確保豬瘟活疫苗(傳代細胞源)的免疫效果。

[1] 吳文福，岑小清，任向陽，等.豬瘟兔化弱毒疫苗的研制概況[J].廣東畜牧獸醫科技，2009，34(6)：6-8.

[2] 張毓金，林旭埜，吳文福，等.豬瘟活疫苗(傳代細胞源)免疫豬的攻毒保護試驗[J].中國獸醫雜志，2014，50(3)：28-30.

[3] 孫彥偉，查云峰，田云，等.三個廠家豬瘟活疫苗(傳代細胞源)免疫效果比較試驗[J].廣東畜牧獸醫科技，2012，37(2)：29-32.

[4] 南文金，黃健強，黃鴻惠，等.某規?；i場豬瘟抗體水平的檢測[J].動物醫學進展，2016，37(3)：120-123.

[5] 原霖，顧曉雪，張碩，等.規?；i場豬瘟免疫失敗調查及免疫程序優化[J].中國獸醫雜志，2013，49(7)：27-29.

The Onset Time and Maintenance Phase of Immunity Protection for Classical Swine Fever Live Vaccine(Cell Line Origin)

REN Xiang-yang1，2，WU Wen-fu1，CEN Xiao-qing1，YOU Qi-you1，LIU Qiu-yan1，LAI Yue-hui1，HUANG Qiu-xue1

(1.Guangdong Win-sun Pharmaceytical Stock Limited Company,Guangzhou 511356, China；2.Guangzhou Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Guangzhou 510623, China)

To evaluate the onset time of immunie protection for Classical Swine Fever Live Vaccine (Cell Line Origin),the piglets together with the control group were injected with strong CSFV 0，1，2，3，4 and 5 days post the inoculation of each batch of the total 3 batches of Vaccine for a single dose. It was observed for 16days after injection with strong CSFV. The results showed that day 4 was the onset time of immunie protection for Classical Swine Fever Live Vaccine (Cell Line Origin).To evaluate the maintenance phase of immune protection for Classical Swine Fever LiveVaccine (Cell Line Origin), the piglets together with the control group were injected with strong CSFV on Months 3，6，9，12 and 15 post the inoculation of each batch of the total 3 batchesof Vaccine for a single dose. It was observed for 16 days after the injection with strong CSFV. The results showed the maintenance phase of immunity protection for Classical Swine Fever Live Vaccine lasted at least 15months(Cell Line Origin).

Classical Swine Fever Live Vaccine (Cell Line Origin)； The Onset Time of Immunity Protection； The Maintenance Phase of Immunity Protection

WU Wen-fu

2016-11-16

任向陽(1981-)，男，獸醫師，碩士，從事獸用生物制品研發與管理工作，E-mail: 1046253137@qq.com

吳文福，E-mail: wuwf18@163.com

S858.23

A

0529-6005(2017)04-0092-03