青蝦源維氏氣單胞菌胞外產物生物學特性及蛋白成分分析

單曉楓，張海月，孫武文，康元環，陳 龍，張冬星，安鼎杰，田佳鑫，錢愛東

(吉林農業大學動物科學技術學院，吉林長春130118)

青蝦源維氏氣單胞菌胞外產物生物學特性及蛋白成分分析

單曉楓，張海月，孫武文，康元環，陳 龍，張冬星，安鼎杰，田佳鑫，錢愛東

(吉林農業大學動物科學技術學院，吉林長春130118)

為了研究維氏氣單胞菌胞外產物在青蝦感染中的致病作用以及維氏氣單胞菌的致病機理，本試驗以青蝦源維氏氣單胞菌QXF0711B為研究對象，提取其胞外產物，采用打孔法測定其胞外產物的酶活性，并對溶血活性進行溶血譜分析，同時分析其致病性。應用液相質譜與串聯質譜相結合方法(LC-MSMS)對其胞外產物蛋白成分進行鑒定，利用Gene Ontology(GO)對已鑒定蛋白進行生物學過程、分子功能和細胞組分的分類分析。結果表明：QXF0711B菌株胞外產物具有淀粉酶活性、脂肪酶活性、蛋白酶活性和溶血活性，不具有明膠酶活性；其可溶解多種動物紅細胞，尤以對魚類紅細胞溶血性更強，但對雞、鴨紅細胞無溶血活性。通過對菌株胞外產物蛋白成分分析顯示有90種蛋白：共參與45種生物學過程，主要涉及碳水化合物代謝過程、運輸等；共有46種分子功能，主要涉及DNA結合、ATP結合、金屬離子結合等；為12種細胞組分，主要包括膜的有機組成、細胞質、細胞外膜等。

維氏氣單胞菌 ； 胞外產物 ； 酶活 ； LC-MSMS ； GO分類分析

維氏氣單胞菌是一種人、獸、水生動物共患病原菌[1]，其可以感染包括人在內的多種動物，患病動物多以出血性敗血癥、腸炎等為主要臨床表征[2-4]。胞外產物(Ex tracellular products，ECP) 是細菌在生長過程中不斷分泌到體外的、具有生物活性的蛋白酶類及毒素類物質。ECP能夠降解宿主蛋白質、多糖、脂質等，并且破壞宿主的免疫系統，促進病原菌在宿主組織中進行繁殖，甚至直接作用于宿主的組織，使組織發生溶解和壞死。目前有關維氏氣單胞菌胞外產物的研究在國內外鮮有報道，本試驗以青蝦源維氏氣單胞菌胞外產物為研究材料，對其主要部分生物學特性及蛋白成分進行分析，為進一步了解維氏氣單胞菌致病機理奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 菌種 青蝦源維氏氣單胞菌QXF0711B株，由浙江省淡水水產研究所潘曉藝副研究員惠贈。

1.2 試驗動物 試驗用斑馬魚，購自長春市某花鳥魚市場，體重0.3～0.4 g，體長3.0～3.5 cm，暫養觀察2周無異常后進行試驗，試驗前禁食24 h

1.3 維氏氣單胞菌胞外產物(ECP)的制備 活化維氏氣單胞菌菌株QXF0711B，接種于不含酚紅的DMEM培養基，28 ℃ 180 r/min振蕩培養36 h后收集培養物，12 000 r/min (4℃)離心30 min，收集上清液。經0.22 μmol/L微孔濾膜過濾除菌后，加入固體硫酸銨至75%飽和度，4 ℃靜置過夜。12 000 r/min(4 ℃) 離心30 min，棄上清液，用0.02 mol/L Tris-HC1(pH值 7.4)緩沖液將沉淀重懸，經透析，聚乙二醇(PEG)10 000濃縮，得到胞外產物，然后涂于TSA固體平板，確定無菌后分裝，-20 ℃保存備用。

1.4 胞外產物的酶活性及溶血性分析 在TSA固體培養基上分別添加可溶性淀粉(2%)、吐溫80(1%)、脫脂牛奶(8%)、明膠(4%)和兔鮮血(7%)，用打孔法測定維氏氣單胞菌ECP的淀粉酶、脂肪酶、蛋白酶、明膠酶酶活性以及溶血活性，并以不含酚紅的DMEM培養基為陰性對照，30 ℃培養 24 h～48 h 后觀察結果。

1.5 胞外產物溶血譜測定 參照Sahu I等[5]的方法略有改進。無菌采取青蝦、鯽魚、草魚、鯉魚、鰱魚、雞、鴨、兔、小鼠等動物紅細胞，并制成2%紅細胞懸液。胞外產物用無菌生理鹽水在96孔板上倍比稀釋，然后加入等量的2%紅細胞，輕輕混勻，37 ℃(或28 ℃)溫箱放置1 h，然后4 ℃冰箱過夜。試驗設置2個對照組：對照組A為不加任何物質的紅細胞稀釋液，對照組B為100%溶血的紅細胞懸液。結果判定標準以50%紅細胞溶解的ECP最高稀釋度為溶血價。

1.6 胞外產物致病性的測定 將190尾健康斑馬魚隨機分成4組：試驗Ⅰ組為純維氏氣單胞菌組、不含有ECP，試驗Ⅱ組注射維氏氣單胞菌胞外產物，試驗Ⅲ組注射處理后的維氏氣單胞菌菌體與胞外產物的混合物，對照組注射無菌PBS(具體情況見表1)，試驗所有組所用斑馬魚腹腔注射10 μL/尾。感染后觀察7 d，統計死亡數量。

1.7 胞外產物蛋白成分鑒定及GO功能分析 純化菌株QXF0711B胞外產物，采用液相色譜與串聯質譜相結合的方法(LC-MSMS)對胞外產物蛋白成分進行鑒定。通過Blast檢索序列相似的模式生物蛋白，對鑒定到的蛋白進行GO功能分析(生物學過程、分子功能和細胞組分)，信息來自UNIPROT(http://www.uniprot.org)網站。

2 結果

2.1 胞外產物的酶活性及溶血性 提取維氏氣單胞菌QXF0711B的胞外產物，測定其酶活性與溶血活性發現：淀粉平板加入盧戈氏碘液后加樣孔周圍出現透明環；吐溫80平板加樣孔周圍出現了不透明的白色暈圈；脫脂牛奶平板加樣孔周圍出現了透明環；兔血培養基平板加樣孔周圍出現了無色透明環；明膠酶培養基平板加樣孔周圍無變化(見中插彩版圖1)。結果表明，維氏氣單胞菌QXF0711B株胞外產物具有淀粉酶活性、脂肪酶活性、蛋白酶活性以及對兔血具有溶血活性，不具有明膠酶活性。

2.2 胞外產物溶血譜測定結果 菌株QXF0711B胞外產物對鯉魚的溶血價最高為26；其次為青蝦、鯽魚、鰱魚和草魚，溶血價均為25；烏鱧溶血價為24；對小鼠和兔溶血價分別為23、22；對雞、鴨紅細胞無溶血作用。

2.3 致病性結果 健康斑馬魚攻毒后均有不同程度的死亡現象產生，在試驗Ⅰ組，當攻菌濃度為5.4×108CFU/mL時全部死亡；試驗Ⅱ組ECP濃度0.56 mg/mL時死亡率為100%，0.28 mg/mL時死亡率為70%，且在攻毒后6 h即發生死亡；試驗Ⅲ組具有較強的致病性，5.4×107CFU/mL的菌液混有0.28 mg/mL胞外產物時死亡率為100%，且攻毒后4 h即發生死亡，12 h時已死亡60%；PBS對照組沒有出現死亡(表1)。2.4 質譜鑒定與蛋白功能分析 運用LC-MSMS方法分析維氏氣單胞菌QXF0711B胞外產物，共檢測出90種蛋白，其中有26種為功能未知蛋白，25種假定蛋白，其余蛋白分別為肽酶S8、鐵轉運蛋白、氣單胞菌毒力因子、亮氨酸-tRNA連接酶、亞硫酸鹽還原酶、氧化還原酶等。

根據所鑒定蛋白的GO注釋信息，對其進行GO分類：其中參與生物學過程的蛋白有59種，這些生物學過程主要包括運輸、DNA模板、碳水化合物代謝過程等；參與分子功能的蛋白共有80種，其中具有DNA結合、ATP結合、金屬離子結合、受體活性功能的蛋白較多；參與細胞組分的蛋白共有41種，這些蛋白主要位于膜的有機組成、細胞質、細胞外膜等。

表1 QXF0711B菌株及其胞外產物致病性分析

3 討論

本試驗對青蝦源維氏氣單胞菌胞外產物的酶活性進行了初步分析。與目前已報道的維氏氣單胞菌胞外產物酶活性存在差異[6]，具體原因可能與分離種類、菌株致病性等不同有關。因為病原菌產生的溶血活性可以導致各組織溶血現象的產生、蛋白酶具有分解膠原等蛋白成分的作用、淀粉能使糖原分解、脂肪酶可分解脂類，因此，當維氏氣單胞菌感染青蝦時，其分泌的ECP的溶血活性與酶活性導致青蝦的各組織溶解，從而為細菌提供了營養物質。隨著時間的延長，細菌增殖的同時酶量也隨即增多，對青蝦外殼、肌肉的破壞程度也不斷增加，從而引起青蝦的出現“軟殼綜合征”[3]。

維氏氣單胞菌胞外產物可溶解多種動物的紅細胞，但對不同動物的紅細胞的敏感性存在差異，其溶血價也不同。鄔向東[7]等發現鱔魚源嗜水氣單胞菌胞外產物，賀揚[6]等發現斑點鮰源維氏氣單胞菌胞外產物對魚類紅細胞溶血價比對其他動物高，與本試驗胞外產物對魚類紅細胞的溶血價比其他動物要高的結果相似。雖然試驗菌株分離自青蝦，但菌株ECP對鯉魚紅細胞溶血價要高于青蝦，其原因可能是菌株在不同動物上致病機理有所區別有關，具體原因，需進行深入研究。

通過對致病性的分析發現，菌體與胞外產物混合感染斑馬魚時毒力最強，短時間內即發生死亡；單獨感染胞外產物也即可導致斑馬魚的發病和死亡，死亡率也較高；但感染維氏氣單胞菌菌體時，死亡數量開始較少，隨著時間的延長，死亡數量呈遞增趨勢，其原因可能注射病原菌組不含有ECP，對魚的致死性依賴于細菌在體內的增殖。

經過GO分類分析發現，蛋白具有較為廣泛的生物學功能覆蓋范圍，從生物學過程中可以看出胞外產物參與調控的蛋白多是參與能量代謝相關途徑，如碳水化合物代謝等。細胞組分分析發現，這些蛋白更多定位于生命活動的主要場所膜的有機組成、細胞質和細胞外膜。分子功能分析表明，這些蛋白的功能集中在DNA結合、ATP結合以及金屬離子結合等。

[1] 單曉楓，康元環，夏京津，等.不同動物源性維氏氣單胞菌生物學特性比較研究[J].中國獸醫雜志，2015，51(3)：82-85.

[2] 李偉杰，趙耘，劉燕，等.狐貍源致病性維氏氣單胞菌的分離鑒定及耐藥性分析[J].中國預防獸醫學報，2012，34(4)：289-292.

[3] 潘曉藝，沈錦玉，李建應，等.青蝦 “軟殼綜合癥” 病原及其特性[J].微生物學通報，2009，36(10)：1 571-1 576.

[4] Rahman M，Colque-Navarro P，Kühn I，etal.Identification and characterization of pathogenicAeromonasveroniibiovarsobriaassociated with epizootic ulcerative syndrome in fish in Bangladesh[J].Applied and environmental microbiology，2002，68(2)：650-655.

[5] Sahu I，Das B K，Marhual N，etal.Toxicity of crude extracellular products ofAeromonashydrophilaon rohu，Labeo rohita(Ham.)[J].Indian journal of microbiology，2011，51(4)：515-520.

[6] 賀揚，華麗，汪開毓，等.高致病性維氏氣單胞菌胞外產物對斑點鮰的致病性[J].水產學報，2016，40(3)：457-467.

[7] 鄔向東，何后軍，周秋白，等.鱔魚嗜水氣單胞菌外毒素的分離純化及活性研究[J].經濟動物學報，2008，12(1)：38-41.

Bioactivity Analysis of extracellular products ofAeromonasveroniistrain isolated from Freshwater Shrimp

SHAN Xiao-feng，ZHANG Hai-yue，SUN Wu-wen, KANG Yuan-huan ，CHEN Long，ZHANG Dong-xing，AN Ding-jie，TIAN Jia-xin，QIAN Ai-dong

(College of Animal Science and Technology， Jilin Agricultural University， Changchun 130118， China)

In order to study the pathogenic role of extracellular products(ECP) and pathogenic mechanism ofAeromonasveroniiisolated from freshwater shrimp,the extracellular products fromAeromonasveroniiQXF0711B were extracted，and the enzyme activity and hemolytic activity of extracellular products were determined by plat stiletto method.LC-MSMS and Gene Ontology method were used to identify the protein components of the extracellular products and analyzing the biological process，molecular function and cellular components of ECP，respectively.Biologic activities showed that the ECP possess amylase and lipase activity，protease and hemolytic activity，but no gelatinase activity.The hemolytic effect of ECP showed a high hemolytic activity to fish erythrocyte，while no hemolytic activity to chicken and duck erythrocyte.The component analysis showed that 90 kinds of proteins were detected in the extracellular products.These proteins involved in 45 kinds of biological processes，especially carbohydrate metabolism process and transport，46 kinds of molecular functions about DNA binding，ATP binding and metal ion binding mainly，and 12 kinds of cellular components including integral component of membrane，cytoplasm and cell outer membrane.

Aeromonasveronii; extracellular products; enzyme activity; LC-MSMS; GO classification analysis

QIAN Ai-dong

2016-09-23

國家自然科學基金項目(31201927)；吉林省科技廳重點科技攻關項目(20150204065NY)

單曉楓(1977-)，男，副教授，博士，從事動物細菌學方面的研究，E-mail：sxf1997@163.com

張海月(1990-)，女，博士生，主要從事分子細菌學研究，E-mail：748436536@qq.com

錢愛東，E-mail：qianaidong0115@163.com

S945.4

A

0529-6005(2017)04-0105-03

注：張海月與單曉楓對本文具有同等貢獻