奶及奶粉中4種阿維菌素類藥物殘留檢測高效液相色譜法

張玉潔，李 丹，李 倩，王鶴佳

(中國獸醫藥品監察所，北京海淀100081)

奶及奶粉中4種阿維菌素類藥物殘留檢測高效液相色譜法

張玉潔，李 丹，李 倩，王鶴佳

(中國獸醫藥品監察所，北京海淀100081)

建立一種適用于牛奶、羊奶和奶粉中乙酰氨基阿維菌素、阿維菌素、伊維菌素和多拉菌素的殘留檢測方法。奶及奶粉中的4種阿維菌素類藥物用20%乙醇乙腈溶液提取，加水和微量三乙胺稀釋后經C18固相萃取柱凈化，氮氣吹干后，65 ℃避光衍生化反應15 min。用高效液相色譜—熒光檢測法分析，外標法定量。4種藥物在0.5～1 000 ng/mL濃度范圍內線性關系良好，在牛奶、羊奶中的定量限為0.5 μg/kg；在奶粉中的定量限為5 μg/kg。一定濃度范圍內，4種藥物在牛奶、羊奶和奶粉中的平均回收率為89.2%～113%；批內變異系數為0.450%～9.73%，批間變異系數為2.90%～10.6%。該方法操作簡單、靈敏度高、準確度和精密度好，適用于牛奶、羊奶及奶粉中阿維菌素類藥物的殘留檢測。

阿維菌素類 ； 奶 ； 奶粉 ； 高效液相色譜法

阿維菌素類藥物是目前應用范圍最廣的抗寄生蟲藥。由于具有較高的脂溶性，阿維菌素和伊維菌素可經乳腺排泄，脂溶性較高的多拉菌素在體內消除緩慢，乙酰氨基阿維菌素極性稍高，乳中濃度較低，可用于防治包括奶牛在內的所有種類牛寄生蟲病[1,2]。阿維菌素類藥物對哺乳動物的毒性很低，但是長期食用含有此類藥物的奶產品會對人類健康產生潛在威脅。我國農業部于2002年發布的第235號公告《動物性食品中獸藥最高殘留限量》中規定阿維菌素禁用于泌乳期牛、羊，多拉菌素禁用于泌乳期牛，伊維菌素在牛奶中的最高殘留限量為10 μg/kg[3]。

阿維菌素類藥物分子量大，主要采用高效液相色譜法進行分析。但目前該類藥物的多殘留檢測方法多集中于對豬、牛、羊等動物組織樣品中的殘留分析研究，而有關牛奶、羊奶及奶粉中殘留檢測的報道較少，尤其是針對羊奶及奶粉的檢測方法，鮮有報道[1,4-5]?，F行的兩個標準方法也存在適用組織不全面以及方法的靈敏度較低的問題[6-7]。因此，本試驗制訂了4種阿維菌素類藥物針對牛奶、羊奶和奶粉的檢測方法，并降低了定量限及檢測限，以便更好地滿足實際檢測工作的需求。

1 材料與方法

1.1 儀器設備、試劑及對照品 Agilent 1100高效液相色譜儀(配熒光檢測器)；SPE柱：Bond Elut C18固相萃取柱(500 mg/6 mL)，或相當者；固相萃取裝置；氮吹儀；高速冷凍離心機；Milli-Q超純水儀等。

阿維菌素、伊維菌素、多拉菌素和乙酰氨基阿維菌素對照品，純度≥91.0%，由中國獸醫藥品監察所提供。甲醇、乙腈、無水乙醇為色譜純，異辛烷、三乙胺為分析純。試驗用水為符合GB/T 6682-2008的一級水。

1.2 溶液配制 20%乙醇乙腈溶液：取無水乙醇20 mL用乙腈稀釋至100 mL。固相萃取柱洗滌液：取乙腈30 mL、水70 mL和三乙胺20 μL，混勻。衍生化試劑A液：N-甲基咪唑-乙腈(1+1，v/v)。B液：三氟乙酸酐-乙腈(1+2，v/v)。均現用現配。

阿維菌素類藥物混合標準儲備液(1 mg/mL)：分別稱取乙酰氨基阿維菌素、阿維菌素、多拉菌素和伊維菌素標準品約10 mg，精密稱定于10 mL量瓶中，用乙腈溶解并稀釋至刻度。配制成濃度為 1 mg/mL 混合標準儲備液，-20 ℃保存，有效期6個月。

阿維菌素類藥物混合標準工作液(10 μg/mL)：準確量取混合標準儲備液0.25 mL于25 mL量瓶中，用乙腈溶解并稀釋至刻度，配制成濃度為 10 μg/mL 混合標準工作液。-20 ℃保存，有效期3個月。

阿維菌素類藥物混合標準工作液(1 μg/mL)：準確量取10 μg/mL阿維菌素類藥物混合標準工作液2.5 mL于25 mL量瓶中，用乙腈溶解并稀釋至刻度，配制成濃度為1 μg/mL 混合標準工作液。-20 ℃ 保存，有效期3個月。

1.3 試驗方法

1.3.1 液相色譜條件 色譜柱: C18250 mm×4.6 mm (i. d)，粒徑5 μm；流動相:乙腈：水(90∶10,V/V)；流速: 1.8 mL/min；檢測波長:激發波長365 nm；發射波長475 nm；柱溫：40 ℃；進樣量: 40 μL。

1.3.2 標準曲線及線性范圍的測定 精密量取100 ng/mL阿維菌素類藥物混合標準工作液0.15、0.5 mL于10 mL量瓶中，用乙腈稀釋至刻度；精密量取1 μg/mL阿維菌素類藥物混合標準工作液0.5、1、2.5、5.0 mL至10 mL量瓶中，用乙腈稀釋至刻度，配制成濃度分別為1.5、5、50、100、250、500 ng/mL乙酰氨基阿維菌素、阿維菌素、多拉菌素和伊維菌素混合標準溶液。取上述6個濃度及1 μg/mL標準工作液各1.0 mL于各自的10 mL試管中，于50 ℃水浴氮氣吹干，按衍生化步驟處理后供高效液相色譜測定。以測得峰面積為縱坐標，對應的標準溶液濃度為橫坐標，繪制標準曲線。求回歸方程和相關系數。

1.3.3 樣品前處理 稱取牛奶、羊奶(5±0.05)g、奶粉(0.5±0.01)g，置50 mL離心管中，加20%乙醇乙腈溶液8 mL，渦旋混勻，中速振蕩5 min，5 000 r/min離心10 min。收集上清液于另一50 mL離心管中。殘渣重復提取1次。合并兩次上清液，加水15 mL和三乙胺50 μL，混勻，備用。

依次用乙腈5 mL、固相萃取柱洗滌液5 mL，活化C18固相萃取柱。將備用液過柱，抽干。加異辛烷3 mL洗滌，抽干。用乙腈5 mL洗脫。收集洗脫液于10 mL試管中，50 ℃下用氮氣吹干。備用。

向試管中依次加入衍生化試劑A液100 μL和衍生化試劑B液150 μL，密閉，渦動10 s，依次加冰醋酸、三乙胺各50 μL，渦動10 s，65 ℃避光密閉反應15 min，取出后加650 μL甲醇混勻。經0.45 μm微孔濾膜過濾，供高效液相色譜檢測。

1.3.4 檢測限及定量限 分別取牛奶、羊奶和奶粉的空白樣品進行添加回收試驗，按照上述樣品前處理方法處理，進HPLC分析。以S/N≥10，且在該添加水平的回收率和變異系數均滿足殘留分析要求的最小濃度作為定量限(LOQ)，以S/N=3作為藥物的檢測限(LOD)。

1.3.5 準確度和精密度 采用標準添加法，在牛奶和羊奶中添加3個不同濃度(0.5 μg/kg、10 μg/kg和50 μg/kg)的阿維菌素類標準溶液進行回收率測定，每個濃度設定5個平行樣品，同時進行空白試驗，重復3次，求每個樣品的回收率和批內、批間相對標準偏差(RSD)。按照相同方法，在奶粉中添加3個不同濃度(5 μg/kg、100 μg/kg和500 μg/kg)的阿維菌素類標準溶液，計算每個樣品的回收率和批內、批間RSD。

2 結果

2.1 標準曲線及線性范圍 4種阿維菌素類藥物在0.5～1 000 μg/L濃度范圍內呈現良好的線性關系，其曲線方程和相關系數(R)見表1所示。

2.2 檢測限及定量限 空白試料按1.3.3步驟處理后，測定結果表明，在相應的保留時間處，不同來源的空白試料對所測分析物均無干擾。圖1～3分別是羊奶空白樣品、標準對照液及0.5 μg/kg羊奶添加樣品的色譜圖。

表1 4種阿維菌素類藥物的回歸方程及相關系數

圖1 空白羊奶色譜圖 圖2 4種阿維菌素類藥物標準溶液色譜圖 圖3 0．5μg/kg羊奶添加樣品的色譜圖

按照S/N=3計算，4種藥物在牛奶和羊奶中的檢測限均為0.2 μg/kg，在奶粉中的檢測限為 2 μg/kg。在牛奶、羊奶中分別添加4種藥物的標準溶液，使其添加濃度分別為0.2、0.5μg/kg和2 μg/kg；在奶粉中添加4種藥物的標準溶液，使其添加濃度分別為2、5μg/kg和20 μg/kg。按照1.3.3提取凈化方法處理后，經HPLC檢測。測定結果顯示，牛奶、羊奶中4種藥物的添加濃度為0.5 μg/kg時，S/N≥10，且回收率均大于90%，變異系數小于8.7%；奶粉中4種藥物的添加濃度為5 μg/kg時，S/N≥10，回收率均大于91%，變異系數小于8.9%。為此，確定該方法中乙酰氨基阿維菌素、阿維菌素、多拉菌素和伊維菌素在牛奶、羊奶組織中的定量限為0.5 μg/kg；在奶粉中的定量限為 5 μg/kg。

2.3 準確度和精密度 牛奶、羊奶和奶粉中3個濃度阿維菌素類藥物添加回收試驗的回收率、批內RSD和批間RSD的匯總結果見表2。

表2 4種阿維菌素類藥物準確度及精密度試驗數據 (n = 5)

由表2數據可知，該方法在牛奶、羊奶和奶粉中的平均回收率為89.2%～113%；批內變異系數為0.45%～9.73%，批間變異系數為2.90%～10.6%。方法準確度、精密度良好。

3 討論

3.1 提取條件的優化 現有標準GB 29696-2013使用乙腈8 mL分兩次提取牛奶中的4種藥物，提取過程簡單，提取效率高[6]。但針對羊奶和奶粉提取效率則顯著降低，羊奶和奶粉中的乙酰氨基阿維菌素回收率分別低于50%和30%，其他3種藥物的回收率也有不同程度的降低。

因此，考慮改變提取液極性，以提高羊奶和奶粉中各藥物的提取效率。乙醇毒性小，極性較乙腈更低，經試驗摸索，在乙腈中加入一定比例的乙醇，確實可以有效提高羊奶和奶粉中的4種藥物的提取效率。但乙醇比例過高，會削弱乙腈沉淀蛋白的能力，后續凈化步驟困難；乙醇比例過低，又會不同程度的影響羊奶，尤其是奶粉中各藥物的提取效率。所以，經進一步摸索，最終確定提取液組成為乙腈∶乙醇=8∶2(v/v)。此提取液對牛奶、羊奶、奶粉3種基質中4種藥物的提取效率均可達到80%以上。

3.2 凈化條件的優化 對動物組織及奶中阿維菌素類藥物的凈化有采用C18固相萃取柱、堿性氧化鋁柱，也有方法采用兩柱聯用[4～7]。張啟迪等比較了堿性氧化鋁柱和C18柱的凈化效果，認為堿性氧化鋁柱凈化效果更好。但其試驗樣本單一，僅針對魚肌肉樣品；檢測藥物僅包括阿維菌素和多拉菌素[8]。現有標準GB 29696-2013及程林麗等檢測牛奶中的4種阿維菌素類藥物，采用了C18柱[6,9]。本方法進一步摸索了C18固相萃取柱的柱效和過柱溶液中有機相和水相的最佳混合比例，最終采用C18固相萃取柱，向提取液中加水15 mL，從而在保證C18固相萃取柱對藥物保留效率的同時也縮短了過柱時間。

3.3 衍生化條件的優化 對阿維菌素類藥物的衍生化試劑普遍使用N-甲基咪唑-乙腈(1+1，v/v)和三氟乙酸酐-乙腈(1+2，v/v)進行，但不同方法間衍生化反應條件有所差異，反應溫度、時間跨度較大，光照要求也不同[4,6,9-10]。經本試驗摸索，目前多數方法采用的室溫下衍生化反應 15 min 或30 min并不充分，尤其是乙酰氨基阿維菌素，隨著反應時間的延長衍生化產物的含量持續升高。

因此，本試驗對衍生化反應的溫度、時間、光照條件進行了更為深入的摸索。首先，在實驗室明亮光照和避光兩種條件下取標準溶液常溫下反應80 min，結果顯示。明亮光照條件下4種藥物的峰面積均明顯低于避光條件下的藥物的峰面積。

然后，對比了避光條件下常溫、50 ℃和65 ℃3種溫度下0、15、30、45、60、75 min及100 min各反應時長的衍生化效率。測定結果顯示，常溫反應80 min和65 ℃反應15 min這兩種條件下4種阿維菌素藥物的衍生產物含量最高，時間延長至100 min，阿維菌素的衍生化產物反而略有減少。

綜合考慮4種藥物的反應效率以及試驗時長，本試驗確定衍生化反應條件為65 ℃避光反應15 min。此反應條件下的衍生化反應效率高、反應充分，并且反應后的衍生化產物加入甲醇后形成的醇式衍生化產物含量穩定，反應結束后立即進樣與存放數小時、1 d以及1周后再進樣所得的檢測組分的峰面積沒有明顯差異。

綜上所述，本試驗建立了一種適用于牛奶、羊奶和各類奶粉中4種阿維菌素類藥物的殘留檢測方法。用乙腈-乙醇溶液提取樣品中的藥物，加水稀釋后經C18固相萃取柱凈化，在65 ℃避光條件下衍生化反應15 min。反應結束后加入甲醇，使衍生化產物形成穩定的醇式衍生化產物，之后用高效液相色譜—熒光檢測法分析，外標法定量。該方法操作簡單，靈敏度高，準確度和精密度好，可以很好地滿足牛奶、羊奶及奶粉中阿維菌素類藥物的實際檢測需要。

[1] 李俊鎖，邱月明，王超. 獸藥殘留分析[M]. 上海: 上海科學技術出版社, 2O02: 257-262.

[2] 何繼紅，申屠芬琴. 阿維菌素類藥物殘留分析技術研究進展[J]. 動物醫學進展，20 09,30(5):98-100.

[3] 中華人民共和國農業部公告第235號 動物性食品中獸藥最高殘留限量[S]，2002.

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[6] 中華人民共和國GB 29696-2013 牛奶中阿維菌素類藥物多殘留的測定 高效液相色譜法 [S]. 2013.

[7] 中華人民共和國國家標準 GB/T 22968—2008 牛奶和奶粉中伊維菌素、阿維菌素、多拉菌素和乙酰氨基阿維菌素殘留量的測定 液相色譜—串聯質譜法 [S].2008.

[8] 張啟迪，鄒明，劉文華，等. 阿維菌素殘留檢測中不同SPE柱凈化效果的比較研究[J]. 中國動物檢疫，2007,24(12)：29-30.

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Determination of 4 kinds of avermectin residues in milk and milk powder by HPLC

ZHANG Yu-jie , LI Dan , LI Qian , WANG He-jia

(China Institute of Veterinary Drug Control , Beijing 100081,China)

An HPLC method for the determination of Eprinomectin, abamectin, ivermectin and doramectin in milk, goat milk and milk powder was developed. The 4 avermectin residues in the samples were extracted with 20%ethanol-acetonitrile solution and the supernatant of the extract was diluted with water and triethylamine, and then applied onto a C18solid phase extraction column for clean-up. The elution was evaporated to dryness and derivatized by 65℃ under darkness for 15 min . The derivatives were achieved by HPLC, and the detection was performed with a fluorescence detector. The calibration curves showed nearly perfect linearity between the peak areas and concentrations of 4 avermectins in range from 0.5 to 1000 ng/mL. The limit of quantification(LOQ) was 0.5 μg/kg for 4 avermectins in milk and goat milk and 5 μg/kg in milk powder. The average recoveries at a range of concentrations were 89.2%-113%, and intra - and inter - batch variation coefficients were 0.450%-9.73% and 2.90%-10.6% respectively. This simple HPLC method with high sensitivity, accuracy and precision can be applied for the detection of avermectins in milk, goat milk and milk powders.

avermectin; milk; milk powder; HPLC

WANG He-jia

2016-10-14

國家農產品質量安全風險評估項目(GJFP201600702)

張玉潔(1981 -)，女，助理研究員，碩士，從事獸藥殘留檢測方法學研究，E-mail:wenkzyj@163.com

王鶴佳，E-mail:pharhejia@163.com

S859

A

0529-6005(2017)04-0088-04