河南地區三黃雞ALV感染的血清學調查

張桂枝，靳雙星，姬向波

(河南牧業經濟學院動物科技學院，河南鄭州450046)

河南地區三黃雞ALV感染的血清學調查

張桂枝，靳雙星，姬向波

(河南牧業經濟學院動物科技學院，河南鄭州450046)

采取河南省3個三黃種雞場種雞的泄殖腔棉拭子和蛋清樣本，利用ELISA檢測ALV-p27；檢測血清中ALV-J、ALV-A/B兩種抗體，同時采集其血液接種DF-1細胞，培養9 d后檢測細胞培養液中ALV-p27。結果表明：3個種雞場泄殖腔棉拭子抗原陽性率分別為12.36%、8.15%和24.28%；蛋清抗原陽性率分別為7.17%、5.09%和14.44%；ALV-A/B抗體陽性率分別為11.96%、6.52%、33.70%；ALV-J抗體陽性率分別為3.26%、2.17%、22.83%；DF-1細胞培養液中ALV-p27陽性率分別為8.57%、6.67%、18.52%。試驗結果為下一階段各雞場開展凈化工作提供了科學依據。

三黃雞 ； 禽白血病 ； p27抗原 ； 血清抗體

禽白血病病毒 (ALV)是一種主要通過種雞傳播的致腫瘤性病毒。早期A、B亞群ALV是引起雞群淋巴性白血病和各類型腫瘤的主要亞群，后來又出現致病性更強的J亞群ALV。我國于1999在商品肉雞中分離檢測到ALV-J，由于前幾年一直未采取全面的禽白血病凈化措施，迄今許多地區蛋雞、肉雞以及地方品種雞群中ALV感染仍較普遍[1-8]。為了解河南地區三黃雞ALV的感染情況，選取河南省2個不同地區及1個疑似禽白血病感染的種雞場三黃雞為研究對象，利用酶聯免疫吸收試驗(ELISA)檢測泄殖腔棉拭子、蛋清ALV-p27抗原；抽取部分雞的血清檢測ALV-J和ALV-A/B兩種抗體；同時抽取部分雞的血液接種DF-1細胞，培養9 d后取細胞上清液檢測ALV-p27，以判斷雞群外源性ALV的感染情況，為實施該地區三黃雞的凈化提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗動物 20～25周齡，3個種雞場1 380只三黃雞。

1.2 主要儀器設備 二氧化碳培養箱(Thermo公司)；NIKON ECLIPSE TS100型倒置顯微鏡，HFsafe-1200生物安全柜，酶標儀(Thermo公司)；微量加樣器等。

1.3 主要試劑 ALV-p27抗原檢測試劑盒，購自BioChek公司；ALV-A/B 和 ALV-J 抗體檢測試劑盒，購自IDEXX公司；DMEM培養液，購自GIBCO公司；新生牛血清，購自GIBCO公司,以及胰酶等。

1.4 細胞 DF-1細胞(河南農業大學保存)。

1.5 方法

1.5.1 泄殖腔棉拭子ALV-p27抗原檢測 采樣前在樣品管中加入1 mL樣品稀釋液，無菌棉簽采集試驗雞泄殖腔棉拭子，與稀釋液混勻后冷凍。反復凍融2次，檢測前將樣品恢復至25 ℃，吸取100 μL上清液，加入到ELISA反應板中，按照ELISA試劑盒的操作說明書進行操作。以405 nm的波長于酶標儀測定對照和樣品的吸光度，通過計算檢測樣品與陽性對照比值(S/P)進行樣品的陰、陽性判定。

1.5.2 種蛋ALV-p27抗原的檢測 收集試驗雞的種蛋，每枚種蛋取1 mL蛋清反復凍融2次后，檢測前將樣品恢復至25 ℃，吸取100 μL蛋清液,加入到ELISA反應板中，按照ELISA試劑盒的操作說明書進行操作。

1.5.3 血清ALV特異性抗體的檢測 采集試驗雞促凝血，4 000 r/min離心10 min分離血清，用稀釋液將血清作1∶500稀釋，然后用禽白血病抗體檢測試劑盒檢測ALV-J亞型及ALV-A/B亞型2種抗體，具體檢測方法參見試劑盒說明書。

1.5.4 DF-1細胞培養液ALV-p27的檢測 無菌采集試驗雞抗凝血，接種于已長成單層的DF-1細胞，37 ℃ 繼續孵育2 h，棄上清液，更換為含有1%新生牛血清的DMEM培養液，在37 ℃、5%CO2條件下繼續培養9 d。然后冷凍，反復凍融2次后，取細胞培養液用ELISA試劑盒檢測ALV-p27抗原。

2 結果與分析

2.1 泄殖腔棉拭子ALV-p27抗原檢測結果 ELISA檢測泄殖腔棉拭子ALV-p27抗原結果顯示，3個種雞場抗原陽性率均較高，但不同場之間有很大差異，其中疑似ALV感染的C場抗原陽性率最高。A、B、C場泄殖腔棉拭子抗原陽性率分別為12.36%(91/736)、8.15%(30/368)和24.28%(67/276)，檢測結果見表1。

表1 泄殖腔棉拭子ALV-p27檢測結果統計

2.2 蛋清ALV-p27抗原檢測結果 ELISA檢測蛋清ALV-p27抗原結果顯示，3個種雞場蛋清樣品中都檢測出抗原陽性個體，其中疑似ALV感染的C場抗原陽性率最高。A、B、C場蛋清抗原陽性率分別為7.17%(33/460)、5.09%(14/275)和14.44%(26/180)，檢測結果見表2。

表2 蛋清ALV-p27檢測結果統計

2.3 血清ALV-A/B和ALV-J抗體檢測結果 ELISA檢測ALV-A/B和ALV-J兩種抗體結果顯示，3個種雞場血清樣品中都檢測出ALV-A/B和ALV-J陽性抗體，其中ALV-A/B抗體陽性率均高于ALV-J陽性抗體率。A、B、C場ALV-A/B抗體陽性率分別為11.96%(11/92)、6.52%(6/92)、33.70%(31/92)；A、B、C場ALV-J抗體陽性率分別為3.26%(3/92)、2.17%(2/92)、22.83%(21/92。檢測結果見表3、表4。

表3 血清ALV-A/B抗體檢測結果統計

表4 血清ALV-J抗體檢測結果統計

2.4 DF-1細胞培養液中ALV-p27抗原檢測結果 DF-1細胞培養9 d的上清液用ELISA試劑盒檢測ALV-p27抗原結果顯示，3個種雞場血液樣品中都檢測出抗原陽性個體，A、B、C三個種雞場抗原陽性率分別為8.57%(3/35)、6.67%(2/30)和18.52%(5/27)，檢測結果見表5。

表5 DF-1細胞培養液中ALV-p27抗原檢測結果統計

3 結論與討論

p27抗原是ALV-亞群共有的主要抗原蛋白，因此,在ALV的檢測和凈化工作中廣泛采用ELISA方法檢測ALV-p27。本試驗采用泄殖腔棉拭子、蛋清及DF-1細胞培養液等多種檢測材料檢測ALV-p27，提高了抗原檢出率。通過研究發現，3個三黃雞場都不同程度的感染了禽白血病病毒。疑似ALV感染的C場，泄殖腔棉拭子、蛋清及DF-1細胞培養液中ALV-p27抗原陽性率均顯著高于A、B場；ALV-A/B和ALV-J抗體陽性率也顯著高于A、B雞場，說明不同的雞場ALV感染程度有很大差異。另外，從檢測結果來看，3個雞場都同時存在ALV-A/B抗體陽性個體和ALV-J抗體陽性個體，但均是ALV-A/B抗體陽性率高于ALV-J抗體陽性率，說明3個雞場都存在ALV-A/B和ALV-J 2種或3種外源性病毒同時感染的可能，但A/B亞群的感染率高于J亞群。對檢測結果進行分析，發現雞群中存在無病毒有抗體(V-A+)、有病毒無抗體(V+A-)和有病毒有抗體(V+ A+)個體，說明本地區ALV 感染的非常復雜。血清型 V+A-的母雞以不同但較高比例向其子代垂直傳播；血清型V-A+存在，說明雞群中存在間歇排毒雞只。所以在凈化過程中需要進行多次檢測並進行淘汰。

喬新永等[6]從三黃雞臨床多發性腫瘤病例中分離出J亞群禽白血病病毒，王培坤等[7]從三黃雞臨床血管瘤病例中分離出AJ亞群禽白血病病毒；張勝斌[11]對廣西地區三黃雞禽白血病進行調查，結果表明，廣西ALV 感染在三黃雞品系內普遍存在，有的場ALV-A/B抗體陽性率高于ALV-J，有的場ALV-J抗體陽性率高于ALV-A/B，有的場2種抗體陽性率接近；本調查結果表明，河南3個三黃雞場ALV-A/B抗體陽性率都高于ALV-J抗體陽性率。以上檢查結果說明，我國的三黃雞有相當比例雞場存在ALV 感染，但不同雞場ALV 感染亞型有差異。因此，各地方品種雞場應根據ALV感染動態、公司規模和發展實力，制定切實可行的凈化措施和凈化方案，盡量減少ALV感染率，減少對后代的垂直傳播，以保護我國優良的地方品種。

[1] 孫淼,李金彩,郭振華,等.J亞型禽白血病病毒的分離與鑒定[J].中國獸醫雜志,2009,45(10)：46-48.

[2] 常維山,郭慧君,孫淑紅.近年來我國禽白血病流行現狀及發展趨勢分析[J].中國家禽，2010，32(1):8-10.

[3] 張洪海,劉青,邱波,等.地方柴雞中J亞群禽白血病與馬立克氏病的混合感染[J.畜牧獸醫學報,2009,40(8):1215-1221.

[4] 王波,李清源,劉紹瓊,等.皖南黃肉種雞種蛋中禽白血病病毒的感染狀態檢測[J].畜牧獸醫學報,2011,42(2):224-227.

[5] 高玉龍,邵華斌,羅青平,等.2009年我國部分地區禽白血病分子流行病學調查[J].中國預防獸醫學報，2010，32(1):32-35.

[6] 喬新永,張維宜，鞠厚斌,等.三黃雞臨床多發性腫瘤相關的亞群禽白血病病毒的分離鑒定及其病理學觀察[J].中國預防獸醫學報，2011，33(2):1-4.

[7] 王培坤,畢玉彧,秦麗莉,等.三黃雞臨床血管瘤病例中分離出A亞群與J亞群禽白血病病毒[J].動物醫學進展，2015,36(3):13-16.

[8] 張勝斌,吳天威,吳丹,等.廣西三黃雞禽白血病流行病學的調查[J].廣西畜牧獸醫，2010，26(1):12-14.

2016-03-16

河南省科技攻關計劃項目(142102110044)；?？萍紕撔聢F隊項目(HUAHE2015003)

張桂枝(1970-)，女，副教授，碩士，從事畜禽疫病防治的教學與科研工作，E-mail：zhangguizhi666@126.com

靳雙星,E-mail:jinshuangxing@126.com

S831.7

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0529-6005(2017)04-0086-02