進境藍舌病抗體陽性動物帶毒分析及檢疫處理研究

喬彩霞，汪 琳，蒲 靜，高志強，劉 環(huán)，艾 軍 ，張 偉，尹 羿

(1. 北京出入境檢驗檢疫局，北京朝陽100026 ； 2. 云南出入境檢驗檢疫局，云南昆明650228)

進境藍舌病抗體陽性動物帶毒分析及檢疫處理研究

喬彩霞1，汪 琳1，蒲 靜1，高志強1，劉 環(huán)1，艾 軍2，張 偉1，尹 羿1

(1. 北京出入境檢驗檢疫局，北京朝陽100026 ； 2. 云南出入境檢驗檢疫局，云南昆明650228)

為評估進口藍舌病病毒(BTV)抗體陽性動物的感染狀態(tài)，分析其帶毒風險，對從國外進口的9批19714頭動物，無菌采集全血分離血清，采用競爭ELISA方法檢測BTV抗體。對BTV抗體檢測陽性的動物，采集抗凝血，采用OIE推薦的套式RT-PCR和熒光RT-PCR方法進行檢測，同時將樣品送往藍舌病參考實驗室進行病毒分離鑒定，以確定動物的藍舌病感染狀態(tài)。結(jié)果9批動物中檢出28頭BTV抗體陽性動物，但核酸檢測和病毒分離鑒定的結(jié)果均表明這些BTV抗體陽性動物并不攜帶有非感染性和感染性病毒粒子。結(jié)合9個批次的進口動物并無明顯臨床表現(xiàn)，且進口動物來源地也無藍舌病(BT)的疫情發(fā)生，據(jù)此根據(jù)OIE《陸生動物衛(wèi)生法典》條款，判定這些抗體陽性動物為帶毒陰性。本研究通過對BTV抗體陽性動物的帶毒分析，并結(jié)合OIE確定BTV感染的要求，對BTV口岸隔離檢疫流程提出建議，以指導(dǎo)動物檢疫工作，阻止病原經(jīng)口岸傳入。

藍舌病 ; 抗體陽性 ; 感染狀態(tài) ; 檢疫

藍舌病(Bluetongue，BT)是由藍舌病病毒(BluetongueVirus，BTV)引起反芻動物的一種非接觸性蟲媒傳播疫病。近年來，BT在全球的流行范圍不斷擴大，BTV的血清型增多且毒力增強，至今已從非洲、歐洲、亞洲、北美、南美和大洋洲的多個國家分離到BTV[1-3]。隨著我國從國外進口種用反芻動物的種類和數(shù)量的增加，BT經(jīng)口岸傳入我國的風險加大，這就要求我們對進境動物進行嚴格的檢疫監(jiān)管以防止疫病傳入我國。

目前，我國要求進境動物必需來自BT非疫區(qū)，并執(zhí)行嚴格的檢疫，一經(jīng)檢出陽性帶毒動物，全群捕殺。2010-2014年間，北京口岸從進口的9批動物中檢出28頭BT抗體陽性動物，涉及動物包括奶牛、長頸鹿和羊駝。本研究對這些BT抗體陽性動物的帶毒情況進行了研究，并提出相應(yīng)的檢疫處理技術(shù)規(guī)范，以指導(dǎo)口岸BT的檢疫工作，保證了進口動物的健康安全和國際貿(mào)易的正常進行。

1 材料與方法

1.1 進口動物樣品 2010-2014年，從北京口岸入境的的9個批次共19 714頭反芻動物，動物種類包括長頸鹿、奶牛、羊駝等，來源國家包括南非、澳大利亞和荷蘭，如表1所示，采集所有入境動物的全血和抗凝血樣品用于研究。

表1 2010-2014年間采集的北京口岸進口反芻動物樣品信息

1.2 主要試劑 用于檢測BTV抗體檢測的試劑盒有3種，分別為法國IDVET公司生產(chǎn)的BTV抗體競爭ELISA試劑盒、美國VMRD公司生產(chǎn)的BTV抗體競爭ELISA試劑盒和美國IDEXX公司生產(chǎn)的BTV抗體競爭ELISA試劑盒。酶包括有GoTaqDNA Polymerase、M-MLV Reverse Transcriptase、RNase inhibitor，購自Promega公司；RNA提取試劑盒(RNeasy? Mini Kit)，購自QIAGEN公司；膠回收試劑盒(E.Z.N.A.? Gel Extraction Kit)，購自Progema公司；dNTP購自北京華美生科生物技術(shù)有限公司；Trans 5K、Trans 2K DNA Marker，購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.3 BTV核酸檢測用引物/探針 按照OIE《陸生動物衛(wèi)生手冊》中推薦的BTV套式RT-PCR和熒光RT-PCR技術(shù)[1]，合成引物和探針，序列見表2，由寶生物工程(大連)有限公司合成。1.4 樣品采集和前處理 無菌采集全血，分離血清后用于BTV抗體檢測。采集可疑動物的抗凝血(抗凝劑為肝素或EDTA)，用PBS磷酸鹽緩沖液(0.01 mol/L，pH值7.2～7.4)洗滌血樣3～4次，每次2 000 r/min離心10 min，棄上清液，加入等量PBS，采用TRIZol法提取RNA后用于BTV核酸檢測；或加入等量乳糖蛋白胨培養(yǎng)液(BLP，含青霉素2 000 IU/mL、鏈霉素2 000 μg/mL)，置冰浴中用超聲波處理(40μA、1min)，用于BTV病毒分離。

表2 檢測用引物、探針的名稱、序列及位置

1.5 ELISA檢測BTV抗體 采用法國IDVET的BTV競爭ELISA試劑盒對進口的9批動物(未進行BTV免疫)的血清樣品進行檢測，對檢測陽性的樣品采用美國IDEXX和VMRD公司的試劑盒重復(fù)進行檢測，比較檢測結(jié)果，最終確定抗體陽性動物。

1.6 套式RT-PCR和熒光RT-PCR檢測BTV核酸 BT抗體檢測陽性的動物，采集抗凝血，經(jīng)處理后提取RNA，采用OIE推薦的套式RT-PCR和熒光RT-PCR方法進行檢測。

套式RT-PCR 分為兩步進行，第一步RT-PCR，每個反應(yīng)的組分：Nuclease-free water 11.8 μL，5× one-step RT-PCR Buffer 5.0 μL，dNTP Mix 1.0 μL，Enzyme1.0 μL，F(xiàn)W primer (25 pmol/mL 0.6 μL，RV primer (25 pmol/μL) 0.6 μL，5 μL RNA，合計25 μL；反應(yīng)程序：50 ℃ 30 min；95 ℃ 15 min；94 ℃ 45 s，58 ℃ 45 s，72 ℃ 60 s，35個循環(huán)；72 ℃ 10 min。第二步套式PCR，每個反應(yīng)的組分：Nuclease-free water 40.75 μL，10×HotStar Buffer 5.0 μL，dNTP Mix 1.0 μL，HotStarTaq0.25 μL，nFW primer (25 pmol/μL) 1.0 μL，nRV primer (25 pmol/μL) 1.0 μL，第一階段擴增的DNA 1.0 μL，合計50 μL；反應(yīng)程序： 95 ℃ 15 min；94 ℃ 45 s ，62 ℃ 45 s ，72 ℃ 1 min，28個循環(huán)；72 ℃ 10 min，反應(yīng)結(jié)束后用1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析PCR擴增結(jié)果。

1.7 病毒分離鑒定 選取BTV抗體陽性動物中抗體滴度較高的10頭動物的抗凝血，經(jīng)處理后進行病毒分離。接種雞胚：無菌靜脈接種10～11日齡發(fā)育良好的SPF雞胚，每份樣品接種5個雞胚，每個雞胚接種0.1 mL樣品，接種后封口，置33.5培養(yǎng)，逐日觀察并記錄，24 h內(nèi)死亡的雞胚為非特異性死亡，將48 h后死亡的雞胚置于4 ℃冰箱保存，于接種后6 d為死亡的雞胚一起收毒。收毒時每個胚體取若干組織塊(有病變時取病變組織)，置乳缽中研磨后，按1∶5加入BLP(含青霉素2 000 IU/mL、鏈霉素2 000 μg/mL)，置4℃浸提4 h后當日使用，剩余樣品置-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

接種敏感細胞：在12孔細胞培養(yǎng)板上培養(yǎng)蚊子細胞(C6/36)細胞單層，將收獲的雞胚上清液，接種細胞單層，每份病料接種兩孔，每孔接種0.1 mL，置25 ℃培養(yǎng)7 d后，收取細胞懸液，接種BHK21細胞單層，37 ℃吸附1 h后，加入維持液置37 ℃培養(yǎng)，逐日觀察細胞病變，連續(xù)觀察7 d。如盲傳2代出現(xiàn)細胞病變，采用RT-PCR試驗進行鑒定。

2 結(jié)果

2.1 ELISA檢測BTV抗體 采用法國IDVET的BTV競爭ELISA試劑盒對北京口岸進口的9批未進行BTV免疫的動物進行檢測，并對檢測陽性的樣品采用美國IDEXX和VMRD公司的試劑盒重復(fù)進行檢測確認，共在9個批次的進口反芻動物中檢出28頭BTV抗體陽性動物，且每1批次均有抗體陽性動物，抗體陽性率為0.03%～66.7%，來自于南非的長頸鹿抗體陽性率最高，平均高達42%，其次為荷蘭的羊駝，陽性率為20%，詳細情況見表3。

2.2 套式RT-PCR和熒光RT-PCR檢測BTV核酸 將BTV抗體檢測陽性的全部18頭動物分別采集抗凝血，經(jīng)處理后提取RNA，分別采用套式RT-PCR和熒光RT-PCR進行檢測，結(jié)果套式RT-PCR有2份在100 bp附件有擴增條帶，經(jīng)基因克隆后測序，測序結(jié)果在GenBank中進行Blast分析，結(jié)果擴增條帶為非特異性擴增不是BTV的基因序列，熒光RT-PCR檢測結(jié)果全部為陰性。結(jié)果表明，18頭抗體陽性動物并不攜帶有非感染性病毒粒子。

表3 ELISA檢測BTV抗體陽性動物結(jié)果

2.3 病毒分離鑒定 選取10頭BTV抗體滴度較高動物的抗凝血，經(jīng)處理后進行病毒分離，雞胚和細胞均未出現(xiàn)病理變化，同時對細胞培養(yǎng)物提取核酸后，經(jīng)RT-PCR和熒光RT-PCR鑒定為陰性，表明動物均不帶有感染性的病毒。

3 討論

藍舌病是世界動物衛(wèi)生組織(OIE)規(guī)定的必須通報多種動物共患病，我國農(nóng)業(yè)部也將其列為一類動物傳染病。我國現(xiàn)行法律規(guī)定，一旦進口動物檢出BTV感染，全群動物將作撲殺、銷毀或退回處理。OIE動物衛(wèi)生法典中規(guī)定，要確定發(fā)生BTV感染，需要滿足以下條件[4]：一是從動物或其產(chǎn)品中分離、鑒定出BTV；二是表現(xiàn)有BT臨床癥狀且排除其他疫病的動物，或與確診或疑似病例有流行病學(xué)關(guān)聯(lián)的動物，或是認為與BTV接觸過的動物，并在其體內(nèi)檢測BTV抗原或特異性核酸(RNA)；三是上述動物非免疫情況下檢出結(jié)構(gòu)蛋白抗體，或免疫情況下檢出非結(jié)構(gòu)蛋白抗體。因此，對于檢疫中未免疫的BTV抗體陽性動物，需要經(jīng)過病毒分離鑒定、核酸檢測或者流行病學(xué)分析，才能確定其BTV感染狀態(tài)。

BTV抗體陽性動物是否帶毒，對其動物個體和同群動物的處置至關(guān)重要。為科學(xué)評估進口BTV抗體陽性動物的感染狀態(tài)，分析其帶毒風險，本研究采集了BTV抗體陽性動物的抗凝血，進行了病毒核酸檢測和病毒分離鑒定。結(jié)果，病毒分離鑒定和核酸檢測的結(jié)果均表明所有BTV抗體陽性動物并不攜帶有感染性和非感染性病毒粒子，結(jié)合9個批次的進口動物并無明顯臨床表現(xiàn)，且進口動物來源地也無BT的疫情發(fā)生，據(jù)此根據(jù)OIE《陸生動物衛(wèi)生法典》條款，判定這些抗體陽性動物為帶毒陰性。

但研究表明，BTV感染后抗體和病原可能共存在于血液循環(huán)系統(tǒng)和免疫器官中，存在帶毒風險[5]，為了進一步降低病毒經(jīng)口岸傳入我國的風險，建議延長隔離檢疫時間，將BTV抗體和核酸檢測陽性樣品送參考實驗室進行確診，以增加臨床和實驗室檢出率，確診動物無感染后方可放行。此外，庫蠓是BT傳播必不可少的媒介[6]，因此進口動物在隔離檢疫期間，除了嚴格按照流程做好實驗室檢驗，還應(yīng)采用庫蠓防護措施[7]，包括噴撒滅蠓藥品或通過霧熏，控制和消滅媒介昆蟲，防止媒介昆蟲造成的潛在傳播風險。

[1] OIE. Terrestrial ManualChapter 2.1.3-Bluetongue [EB/OL].http://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Health_standards/tahm/2.01.02_Bluetongue.pdf.2014.

[2] 何宇乾，吳海燕，徐瓊.藍舌病的流行現(xiàn)狀[J]．中國獸醫(yī)科學(xué)，2012，42(5)：537-540.

[3] 苗志強，鄭明學(xué)，古少鵬，等. 藍舌病的流行狀況及防控措施[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2010，5：28-30.

[4] OIE.Terrestrial Code Chapter 8.3- Infection with bluetongue virus. [EB/OL].http://www.oie.int/index.php?id=169&L=0&htmfile=chapitre_bluetongue.htm.

[5] Giovannini A, MacDiarmid S, Calistri P,etal. The use of risk assessment to decide the control strategy for bluetongue in Italian ruminant populations [J]. Risk Analysis, 2004,24:1737-1753.

[6] Brugger K, Rubel F. Bluetongue disease risk assessment based on observed and projected Culicoides obsoletus spp. vector densities [J]. PLoS ONE, 2013, 8： e60330.

[7] Maclachlan N J, Mayo C E. Potential strategies for control of bluetongue, a globally emerging, Culicoides-transmitted viral disease of ruminant livestock and wildlife [J]. Antiviral Res， 2013,99(2):79-90.

Virus carrier analysis andentry-exit quarantine of bluetongue virus seropositive animals in international trade

QIAO Cai-xia1, WANG Lin1, PU Jing1, GAO Zhi-qiang1, LIU Huan1, AI Jun2, ZHANG Wei1, YIN Yi1

(1.Beijing Enrty-exit Inspection and Quarantine Bureau , Beijing 100026 ，China； 2.Yunnan Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau , Kunming 650228,China)

The objective of the present study was to investigate the infection status and virus carrier state of bluetongue virus (BTV) seropositive animals. In this study, 19714 sera were aseptically collected from 9 batches of imported animals and tested for anti-BTV antibodies by competitive ELISA. For the seropositive animals, the presence of BTV was detected using real-time RT-PCR or RT-nPCR from anticoagulant-treated whole blood according to the recommendation of OIE. Meanwhile, to confirm the infection status, all positive samples were sent to the BT reference laboratory at Yun Nan Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau and subjected to virus isolation. Among the19714 animals that were tested, 28 were positive for antibodies against BTV. However, infectious or noninfectious virus could not be detected by virus isolation (VI) technique or nucleic acid tests. Furthermore, there were no significant clinical symptoms present in the 9 batches of imported animals, and the origin place had no BT epidemic. Based on the above results and relevant items in the OIE“Terrestrial Animal Health Code”, the conclusion was drown that there was no virus presence in seropositive animals.Also, the quarantine procedure for BTV was proposed in this study according to the detection of virus from BTV seropositive animal and the requirement for definite diagnosis of BT by OIE, which will be useful for specific guidelines for trading animals quarantine and preventing potential invasion of BTV.

bluetongue； seropositive ； infection status ； quarantine

2016-01-22

國家質(zhì)檢總局科技計劃項目(2014IK249)

喬彩霞(1978-)，女，高級獸醫(yī)師，博士，主要從事動物疫病檢測技術(shù)研究 ，E-mail:qiaocx@bjciq.gov.cn

S852.65+9

A

0529-6005(2017)04-0079-03