一例牛支原體與多殺性巴氏桿菌混合感染的診斷與治療

高 鐸，孔令聰，高云航，王 梓，賈博巖，劉樹(shù)明，辛九慶，馬紅霞

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院， 吉林長(zhǎng)春130118； 2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所， 黑龍江哈爾濱150001)

一例牛支原體與多殺性巴氏桿菌混合感染的診斷與治療

高 鐸1，孔令聰1，高云航1，王 梓1，賈博巖1，劉樹(shù)明1，辛九慶2，馬紅霞1

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院， 吉林長(zhǎng)春130118； 2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所， 黑龍江哈爾濱150001)

某肉牛養(yǎng)殖場(chǎng)經(jīng)長(zhǎng)途運(yùn)輸?shù)臓倥１┌l(fā)肺炎，并發(fā)生大規(guī)模死亡。經(jīng)主訴和臨床癥狀的分析、肺臟病變觀察、病原的形態(tài)學(xué)檢查、分子生物學(xué)鑒定，結(jié)果確診為牛支原體(M.bovis)與莢膜血清多殺性巴氏桿菌(A型P.mutocida)混合感染。根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果推薦該場(chǎng)使用恩諾沙星肌肉注射輔以電解多維對(duì)患病牛進(jìn)行治療，疫情得到有效控制。

牛呼吸系統(tǒng)疾病 ； 牛支原體 ； 多殺性巴氏桿菌 ； 混合感染 ； 抗菌藥物敏感性試驗(yàn)

經(jīng)長(zhǎng)途運(yùn)輸?shù)娜馀Ｒ谆寂：粑到y(tǒng)疾病(Bovine respiratory disease，BRD)，其不但造成一定死亡率，還能影響肉牛育肥，已成為危害肉牛產(chǎn)業(yè)最為嚴(yán)重的疾病之一。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)，牛支原體(Mycoplasmabovis,M.bovis)單獨(dú)致病或與多殺性巴氏桿菌(Pasteurellamutocida,Pm)等細(xì)菌混合感染協(xié)同致病成為引發(fā)BRD的重要致病原因之一[1-3]。2013年8月末，通遼市某肉牛養(yǎng)殖場(chǎng)經(jīng)長(zhǎng)途運(yùn)輸?shù)臓倥１┌l(fā)肺炎，并發(fā)生大規(guī)模死亡。該場(chǎng)送檢樣品為發(fā)生肺炎的犢牛肺臟和含有患牛漿液性鼻涕的鼻拭子，通過(guò)對(duì)主訴和臨床癥狀與肺臟病變的分析，以及實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)確診該場(chǎng)暴發(fā)的是M.bovis與莢膜血清A型P.mutocida混合感染造成的BRD。通過(guò)病原體的抗菌藥物敏感性試驗(yàn)(Antibiotic Susceptibility Testing，AST)結(jié)果，推薦該場(chǎng)使用恩諾沙星肌肉注射輔以電解多維對(duì)患病牛進(jìn)行治療，疫情得以控制，未見(jiàn)新發(fā)病例。報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 病料來(lái)源 采自通遼市某肉牛養(yǎng)殖場(chǎng)患呼吸系統(tǒng)疾病犢牛的鼻拭子。

1.2 主要試劑Taq酶等，均購(gòu)自TakaRa公司；PPLO肉湯培養(yǎng)基、腦心浸湯(BHI)培養(yǎng)基，均購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限責(zé)任公司；紅霉素等8種抗生素標(biāo)準(zhǔn)品，均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。疊氮鈉、丙酮酸鈉、細(xì)菌基因組DNA快速抽提試劑盒，均購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。

1.3 病原分離鑒定 將病牛鼻拭子樣本分別接種于改良的PPLO液體培養(yǎng)基(含青霉素與疊氮鈉)中和BHI培養(yǎng)基中，培養(yǎng)方法參考文獻(xiàn)[1、2]。

1.4 分子生物學(xué)鑒定 使用細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒提取M.bovis和牛源P.mutocida基因組。

1.4.1 牛支原體特異性鑒定及16S rRNA序列分析 參考Rifatbegovic等合成M.bovisoppD/F基因特異性引物對(duì)疑似菌株進(jìn)行PCR鑒定，預(yù)計(jì)擴(kuò)增出1 912 bp的目的條帶。參考辛九慶等合成擴(kuò)增16S-rRNA全長(zhǎng)引物，預(yù)計(jì)擴(kuò)增出約1.5 kb的目的條帶[4]。PCR產(chǎn)物測(cè)序后與GenBank中登錄菌株的16S rRNA序列比對(duì)分析。

1.4.2 牛源多殺性巴氏桿菌特異性鑒定、基因分型 參考Townsend合成P.mutocida種特異性基因引物Kmt1，A、B、D莢膜血清型特異性基因引物capA、capB、capD，使用多重PCR對(duì)疑似菌株進(jìn)行鑒定，預(yù)計(jì)擴(kuò)增出460 bp和1 020 bp的特異性條帶[2]。自行設(shè)計(jì)P.mutocida16S rRNA全長(zhǎng)引物，預(yù)計(jì)擴(kuò)增出約1.5 kb的目的條帶，引物序列為：Forward：5′-TCAGATTGAACGCTGGCGGCAGGCTTAAC-3′;Reverse：5′-CACCCCAGTCATGAATCATACCGTGGTAA-3′.各PCR產(chǎn)物測(cè)序后與GenBank中登錄菌株比對(duì)分析。

1.5 菌落計(jì)數(shù) 用常規(guī)方法對(duì)P.mutocida進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，用倍比稀釋法測(cè)定M.bovis的顏色變化單位(Colour change unit,CCU)[5]。動(dòng)物回歸試驗(yàn)選取107CFU/mLP.mutocida菌懸液作為接種菌液[2]。P.mutocida和M.bovisAST菌液最佳濃度分別為5×104～5×105CFU/mL和103～104CFU/0.2mL[5-6]。

1.6 動(dòng)物回歸試驗(yàn) 取SPF級(jí)BALB/c健康小鼠4只，第1～3只胸腔注射菌量為107CFU/mL的3株P(guān).mutocida菌懸液200 μL，第4只胸腔注射無(wú)菌生理鹽水作為對(duì)照，逐日觀察小鼠發(fā)病及死亡情況。

1.7 抗菌藥物敏感性試驗(yàn) 根據(jù)美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(CLSI)的指導(dǎo)方針[6]，參考《支原體學(xué)》[5]，將各抗生素溶解并稀釋成2 048 μg/mL的抗生素貯存液。采用改良的微量稀釋法AST測(cè)定M.bovis對(duì)抗菌藥物的體外敏感性；采用瓊脂稀釋法AST測(cè)定P.mutocida對(duì)抗菌藥物的體外敏感性。P.mutocida和M.bovisAST的敏感、中度敏感、耐藥標(biāo)準(zhǔn)主要參考CLSI[6]，即氟喹諾酮類(lèi)：MIC≤0.25定義為敏感，MIC=0.5-1定義為中度敏感，MIC≥2定義為耐藥；大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)：MIC≤16定義為敏感，MIC=32定義為中度敏感，MIC≥64定義為耐藥；四環(huán)素類(lèi)和氟苯尼考：MIC≤2定義為敏感，MIC=4定義為中度敏感，MIC≥8定義為耐藥。質(zhì)控菌株為金黃色葡萄球菌ATCCR29213和大腸埃希菌ATCC?25922，其MIC值均在CLSI允許的范圍內(nèi)。

2 結(jié)果

2.1 臨床癥狀及病理剖檢結(jié)果 主訴：病牛精神沉郁、咳嗽、氣喘、伴有漿液性鼻涕、體溫升高、嚴(yán)重者呼吸困難并且進(jìn)食停止；有的患牛伴有拉稀或繼發(fā)關(guān)節(jié)炎。發(fā)生肺炎的肺臟質(zhì)地變硬，肺臟表面廣泛分布黃白色干酪樣壞死灶(如中插彩版圖1)。

2.2 病原的形態(tài)學(xué)檢查結(jié)果 采集的3頭病牛鼻拭子中各分離得到3株疑似M.bovis與3株疑似P.mutocida。疑似M.bovis菌株在低倍顯微鏡下的菌落均呈典型的“油煎蛋”樣(如中插彩版圖2)。疑似牛源P.mutocida在BHI培養(yǎng)基中菌落為圓形、光滑呈露滴狀。取典型菌落涂片，染色鏡檢，均為革蘭陰性小桿菌，美藍(lán)染色呈明顯的兩極著色。

2.3 分子生物學(xué)鑒定結(jié)果

2.3.1 牛支原體的分子生物學(xué)鑒定 利用M.bovisoppD/F基因特異性引物擴(kuò)增出1 912 bp的片段，與預(yù)期片段大小相符。證明所分離的3株疑似菌株均為M.bovis。結(jié)果如圖3所示。利用16S rRNA全長(zhǎng)引物擴(kuò)增出約1.5 kb的片段，與預(yù)期片段大小相符(圖略)，該基因片段測(cè)序后使用BLAST對(duì)其堿基序列進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，所分離菌株的16S rRNA相應(yīng)序列與模式株P(guān)G45和國(guó)內(nèi)臨床分離株HB0801與Hubei-1相應(yīng)序列同源性均為99%，與無(wú)乳支原體PG2相應(yīng)序列同源性為98%。

圖3 M.bovis的oppD/F基因的擴(kuò)增結(jié)果M:DL-2 000; 1-3：P9,P10,P11oppD/F基因PCR產(chǎn)物; 4：陽(yáng)性對(duì)照

圖4 P.mutocida的kmt1+capA基因的擴(kuò)增結(jié)果M:DL-2 000;1-3:TL-1,TL-2,TL-3kmt1+capA基因PCR產(chǎn)物4:陽(yáng)性對(duì)照

2.3.2 牛源多殺性巴氏桿菌的分子生物學(xué)鑒定與基因分型P.mutocida經(jīng)多重PCR均擴(kuò)增得到460 bp和1 000 bp的特異性條帶，符合kmt1+capA基因擴(kuò)增結(jié)果，測(cè)序后運(yùn)用BLAST對(duì)堿基序列進(jìn)行分析，其比對(duì)結(jié)果與GenBank中P.mutocida36950株同源性均高達(dá)99%，個(gè)別菌株之間有無(wú)意義點(diǎn)突變，證明所分離菌株均為牛源莢膜血清A型P.mutocida。結(jié)果如圖4所示。通過(guò)自行設(shè)計(jì)的16S rRNA全長(zhǎng)引物擴(kuò)增出約1.5 kb的片段，與預(yù)期片段大小相符(圖略)，測(cè)序后使用BLAST對(duì)其堿基序列進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，所分離菌株的16S rRNA與GenBank中P.mutocida36950株同源性均高達(dá)99%。

2.4 動(dòng)物回歸試驗(yàn)結(jié)果 注射107CFU/mL 3株P(guān).mutocida菌液的小鼠均具有精神不振、食欲下降的癥狀，并在12 h內(nèi)死亡，剖檢各組死亡小鼠，肺臟觸片，堿性美藍(lán)染色，可見(jiàn)兩極著色的菌體。對(duì)照小鼠24 h內(nèi)全部正常且剖檢后無(wú)病理變化。

2.5 抗菌藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果 微量稀釋法測(cè)定3株M.bovis的MIC顯示，P11對(duì)紅霉素耐藥(MIC≥64 μg/mL)，3株M.bovis均對(duì)阿奇霉素和吉他霉素敏感(MIC≤16 μg/mL)，對(duì)強(qiáng)力霉素敏感(MIC≤2 μg/mL)，對(duì)恩諾沙星敏感(MIC≤0.5 μg/mL)，P9對(duì)氟苯尼考耐藥(MIC≥8 μg/mL)，P10對(duì)氟苯尼考敏感(MIC≤2 μg/mL)；瓊脂稀釋法測(cè)定3株P(guān).mutocida的MIC顯示，P.mutocida8除對(duì)泰樂(lè)菌素中度敏感(MIC=32 μg/mL)外，對(duì)其他各抗生素均敏感，其余兩株P(guān).mutocida亦對(duì)各抗生素敏感。見(jiàn)表2。

表2 8種臨床常用抗生素對(duì)分離菌的藥敏試驗(yàn)結(jié)果 (μg/mL)

2.6 治療 通過(guò)對(duì)AST結(jié)果進(jìn)行比較，推薦該場(chǎng)使用對(duì)兩種病原均有較好抑菌作用的恩諾沙星作為治療首選藥物，1次/天，同時(shí)輔以電解多維，用于補(bǔ)充機(jī)體所需的營(yíng)養(yǎng)成分，使病牛得以更快康復(fù)。據(jù)悉，該場(chǎng)按本實(shí)驗(yàn)室推薦方案進(jìn)行治療后，疫情得以有效的控制。用藥后，未新增死亡病例，一周之內(nèi)患牛大部分痊愈，未見(jiàn)新發(fā)病例，極大的減少了該場(chǎng)的經(jīng)濟(jì)損失。

3 討論

本試驗(yàn)通過(guò)主訴、臨床癥狀的分析、肺臟病變觀察、病原的形態(tài)學(xué)檢查、分子生物學(xué)鑒定等方法，確認(rèn)同時(shí)從病牛鼻拭子中分離出的兩種微生物分別為M.bovis與莢膜血清A型P.mutocida，從而確診該場(chǎng)暴發(fā)的是M.bovis與莢膜血清A型P.mutocida混合感染造成的牛呼吸系統(tǒng)疾病。M.bovis的感染通常伴隨著其他致病菌尤其是P.mutocida的混合感染，且致病菌的混合感染往往可以比單獨(dú)感染給患牛帶來(lái)更高的發(fā)病率和死亡率，Soehnlen M K.等對(duì)美國(guó)賓夕法尼亞州采集的90份樣品進(jìn)行BRD主要病原的檢測(cè)，結(jié)果顯示，M.bovis、P.mutocida和溶血性曼氏桿菌單獨(dú)感染檢出率分別為41%、1.1%和1.1%，而M.bovis和P.mutocida混合感染檢出率為7.8%，M.bovis和溶血性曼氏桿菌混合感染檢出率為4.4%[7]；在國(guó)內(nèi)近幾年BRD混合感染病例中，主要也為莢膜血清A型P.mutocida和M.bovis混合感染[2-3]。目前普遍認(rèn)為，長(zhǎng)途運(yùn)輸?shù)拳h(huán)境因素刺激是暴發(fā)BRD的重要原因之一。所以，今后合理進(jìn)行“異地育肥”，在運(yùn)輸途中通過(guò)保健藥物或其他手段緩解應(yīng)激可能是減少該病發(fā)病率的途徑之一。

該場(chǎng)依據(jù)本試驗(yàn)結(jié)果給出的指導(dǎo)建議，成功控制了由M.bovis與莢膜血清A型P.mutocida混合感染引發(fā)的BRD，對(duì)今后治療和控制該疾病的暴發(fā)起到一定的指導(dǎo)作用，提供了理論依據(jù)。如何快速的針對(duì)引發(fā)BRD的病原及時(shí)提出合理的治療方案將是今后研究的熱點(diǎn)方向之一。

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2014-08-04

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31272611)；教育部新世紀(jì)優(yōu)秀人才項(xiàng)目(NCET-10-0174)；吉林省世行貸款農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全項(xiàng)目(2011-Y05)；吉林省牧業(yè)管理局項(xiàng)目(20120113)

高鐸(1989- )，男，碩士生，從事動(dòng)物藥理與毒理學(xué)研究，E-mail：goddard518@126.com

馬紅霞，E-mail：hongxia0731001@163.com

S852.65+3

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0529-6005(2017)04-0049-03