生豬乙型腦炎抗體消長規律及蚊子攜帶乙腦病毒調查

向衛軍，楊濤濤，劉 浩，羅季偉，余興龍

(1.湖南農業大學動物醫學院， 湖南長沙410128； 2.長沙市動物衛生監督所， 湖南長沙410013)

生豬乙型腦炎抗體消長規律及蚊子攜帶乙腦病毒調查

向衛軍1，楊濤濤1，劉 浩2，羅季偉1，余興龍1

(1.湖南農業大學動物醫學院， 湖南長沙410128； 2.長沙市動物衛生監督所， 湖南長沙410013)

為探尋豬場仔豬乙型腦炎抗體消長與蚊子攜帶乙型腦炎病毒的之間的關系， 4月份選取一批約15日齡仔豬共24頭， 每隔20 d采血1次， 至7月共采血6次， 用間接ELISA 方法檢測血清乙型腦炎抗體， 且不同時間在跟蹤豬舍共捕獲約3720只蚊子， 用RT-PCR 方法鑒定乙型腦炎病毒核酸； 結果表明， 該批豬乙型腦炎抗體陽性率總體呈現先下降后升高規律， 陽性率先后為83.3%、 66.7%、 41.6%、 25%、 50%、 91.6%， 生豬體內母源抗體水平在75日齡(6月20日)達到最低， 陽性率降至25%， 然后呈現明顯的上升趨勢， 115日齡(7月30日)檢測陽性率高達91.6%； 37份蚊子樣品， JEV核酸陽性樣品16份， 陽性率高達43.2%， 其中7月份所采集14份蚊子樣品檢出7份，乙型腦類病毒(JEV)陽性檢出率最高達50%， 表明在乙型腦炎流行季節， 受蚊子攜帶病毒及其叮咬影響， 當仔豬JEV抗體下降最低時JEV易感， 后期感染抗體升高。

乙型腦炎病毒 ； 仔豬 ； 抗體 ； 蚊子

流行性乙型腦炎是由黃病毒科黃病毒屬的乙型腦炎病毒引起的一種重要的蚊媒性人獸共患傳染病，多種動物易感。對于易感動物來說，乙型腦炎是一種潛在的致死性病毒性感染疾病，也是嚴重威脅人畜健康的一種中樞神經系統的急性傳染病，同時也是亞洲病毒性腦炎的主要原因。乙型腦炎以三帶喙庫蚊為主要傳播媒介，屬于自然疫源性疾病，豬是乙型腦炎病毒的重要貯存宿主與增殖宿主，是乙型腦炎的主要傳染源，也是對人類威脅最大的擴散宿主，主要流行模式是JEV在“蚊-豬-蚊”中循環繁殖。JEV可引起妊娠母豬發生流產和死胎、公豬發生睪丸炎，新生仔豬發生腦炎、育肥豬持續高熱，對養豬業造成巨大的經濟損失。在JE流行季節，豬在自然感染后形成病毒血癥，JE病毒血癥會持續2～4 d并且能感染蚊子。Burke等[1]通過血清學調查，豬始終比其他家畜或野生動物有更高的病毒滴度，豬群對吸血蚊子更具有吸引力，所以豬群在JEV流行區提供該病毒傳播的敏感指示器。Gajanana等[2-3、7-8]研究發現，人類感染JEV通常是因為被感染的蚊子叮咬，同時對JEV生態學發現，病毒的傳播與蚊蟲的滋生環境有很大關系，其病毒媒介(蚊子)以及人類居住區附近的生豬養殖場等之間相互影響。在JEV流行區域，特別是生豬養殖的地區，豬作為JEV傳播的敏感指示器，對其進行血清學調查、豬群養殖環境中蚊蟲檢測具有重要意義。筆者于2015年4月～7月，即湖南地區蚊蟲開始出沒至蚊蟲繁殖高峰期這一時間段，在湖南某種豬場通過對一批豬從15日齡～115日齡進行縱向跟蹤采血并檢測JEV抗體，同時定期采集實驗豬欄舍環境中蚊子進行JEV核酸檢測，探尋兩者之間關系，提出免疫時間等，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 豬血清樣品 2015年4月，在湖南省岳陽汨羅某種豬場選取未經JEV流行季節的仔豬，選取同批次約14日齡仔豬共12窩，每窩隨機選取2頭，共24頭，第一次采血做好耳標標識，每隔20天左右采血1次，共采血6次。

1.2 蚊子采集

1.2.1 采集點 在采血跟蹤豬欄舍放置捕蚊燈，欄舍前中后各放置一套，每隔2周采集1次。

1.2.2 捕蚊方法和鑒定 于2015年4月16日至7月30日期間，晚20:00至22:00，用日光燈誘蚊捕獲蚊子，欄舍內掛3個誘蚊燈，捕獲蚊蟲經-20 ℃凍死，進行計數、分裝入塑料管，標號登記，用于乙腦病毒的鑒定。

1.3 試劑

1.3.1 豬乙型腦炎病毒抗體檢測試劑盒 豬乙型腦炎ELISA 抗體試劑盒為武漢科前生物股份有限責任公司產品，用于豬乙型腦炎病毒抗體檢測(試劑盒批號：20141108)。

1.3.2 RNA提取、CDNA合成 柱式病毒RNAout試劑盒、即用型PCR試劑盒均為北京天恩澤基因科技有限公司產品；DM-2 000 plus marker為康為世紀公司產品。

1.4 樣品處理與檢測

1.4.1 樣品預處理 將不同時間段、不同采集點所采集的蚊子樣品分別分裝到2 mL離心管中，每管100只，然后加入無RNA水于勻漿機研磨2min，4 ℃條件下12 000r/min離心5min后取200 μL上清用于提取RNA。

1.4.2 蚊蟲RNA提取、cDNA合成 參照天恩澤基因柱式病毒RNAout試劑盒說明書提取蚊子樣品濾液的RNA，并按Thermo逆轉錄試劑盒說明書合成cDNA，PCR反應程序為25 ℃/20 min；42 ℃/45 min；72 ℃/5 min；10 ℃保存，反轉錄完畢后將cDNA放入-20 ℃保存。

1.4.3 PCR鑒定 采用天恩澤基因即用型PCR試劑盒配制體系并擴增。根據JEV NS5設計引物，上游引物：5′-AAGCCCTCAG AACCGTCTCG-3′；下游引物：5′-CTCCTCTAACCTCTAGTCCTTC-3′PCR反應程序：94 ℃ 預變性5 min，開始PCR循環，94 ℃變性30 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，擴增35個循環，最后72 ℃延伸7 min。取5 μL PCR產物在0.8%瓊脂糖凝膠進行電泳鑒定。

2結果

2.1 24頭仔豬15日齡至115日齡6次跟蹤血清乙型腦炎抗體結果 見表1。根據試劑盒說明書，若樣品S/P值≥0.21，判為豬乙型腦炎病毒抗體陽性；樣品S/P值<0.21，判為豬乙型腦炎病毒抗體陰性。結果顯示，抗體陽性率與平均S/P值總體呈現先下降后升高規律，而且兩者在時間上一致，JEV抗體平均S/P先后為，0.335、0.221、0.211、0.210、0.232、0.311，從表1可看出下降最低點為75日齡，從15日齡0.335下降至75日齡0.210，上升最高點為115日齡，從75日齡0.210至115日齡0.311；JEV抗體陽性率先后為83.3%、66.7%、41.6%、25%、50%、91.6%，從圖2可看出，75日齡(6月20日)為25%，為陽性率最低時開始呈現明顯的上升趨勢，至115日齡(7月30日)陽性率高達91.6%。

表1 不同日齡階段豬JEV抗體平均S/P值

圖1 各日齡階段豬JEV抗體平均陽性率

圖2 RT-PCR鑒定蚊子樣品JEV陽性樣品

1：陰性對照， 2：陽性對照， 3：陰性樣品， 陰性， 4：弱陽性樣品，5：陽性樣品

2.2 蚊子樣品中JEV陽性樣品PCR鑒定 PCR擴增乙型腦炎NS5基因片段，符合目的條帶大小(約270 bp)定為陽性樣品，PCR擴增產物經電泳后結果(見圖3)。共對37份蚊子樣品進行了JEV鑒定，JEV陽性樣品共16份，陽性率為43.24%。從4月20日至7月30日，六次采集蚊子樣品總份數、JEV核酸檢測率(見表2 )，同時統計2015年4月至7月每半個月中，每日最高與最低平均氣溫與核酸檢測率的關系(見圖3)，可得出JEV核酸檢出率隨氣溫升高有逐漸增加的趨勢。

圖3 JEV核酸檢出率與平均氣溫

表2 蚊子樣品采集及其JEV核酸檢測

注：1份蚊子樣品大約100只

3 結論與討論

經過本調查研究，在乙型腦炎流行、蚊蟲活躍季節、適合蚊蟲滋生的豬場， 未免疫仔豬JEV抗體的先下降后升高的過程，這與豬場環境中蚊子密度、攜帶JEV病毒量以及氣溫有關，氣溫越高蚊子活動越頻繁，單位時間蚊子叮咬次數增加，JEV通過蚊子傳播機率越大。

經調查國內大部分豬場只有種豬注射JEV疫苗[4-6]，根據這次跟蹤豬場免疫程序，每年3、9月份種豬普免、后備豬留種前進行2次乙型腦炎疫苗免疫，但是仔豬不免疫JEV疫苗，在流行季節豬只有感染JEV后導致抗體升高的可能。由于母源抗體的存在，15日齡仔豬陽性率與S/P值較高，隨之慢慢下降，抗體拐點在75日齡(7月30日)，檢測的S/P值與陽性率分別為0.210%、 25%，從此日齡階段抗體開始呈現明顯的上升趨勢，至115日齡(7月30日)檢測S/P值為0.311%，陽性率高達91.6%，說明在母源抗體較低的豬只被攜帶病毒的蚊子叮咬后，仔豬感染JEV后使抗體值得以升高。同時統計2015年4月至7月份每半個月中，每日最高與最低平均氣溫與JEV核酸檢測率的關系中可得出JEV核酸檢出率隨氣溫升高有逐漸增加的趨勢，這樣隨著氣溫的升高，蚊子密度的增大、感染豬只增多，JEV量通過“蚊-豬-蚊”循環得以增加，將所采集的蚊子檢測做JEV核酸檢測，結果發現蚊蟲JEV感染率高達43.2%，魏燕鳴[7]2009年6月至8月在湖北、安徽兩省部分豬場采集蚊子樣品檢測JEV，53 份樣品中陽性樣品有44 份，陽性率達83%，表明在JEV流行季節，豬場蚊子帶JEV陽性率較高，在蚊子活躍、乙型腦炎流行的高溫季節，受蚊子攜帶病毒及其叮咬影響，當仔豬JEV母源抗體下降最低時JEV易感，后期感染抗體升高。

在當前大部分豬場免疫方式下，即只免疫種豬不免疫仔豬，在蚊蟲活躍季節，未免疫豬存在乙型腦炎感染的高風險，根據該場仔豬JEV抗體消長規律，建議在仔豬50至55日齡豬免疫一次乙型腦炎疫苗，可以有效防止JEV對育肥豬感染后引起發熱、后備種豬繁殖障礙等情況，更重要的是在“蚊-豬-蚊-人”這一循環中，有效減少乙型腦炎病毒放大宿主豬的載毒量，從而減少蚊子攜帶病毒的含量，乙型腦炎是季節性流行病，各豬場應根據不同季節、本場仔豬乙型腦炎母源抗體消長情況、感染情況等科學制定乙型腦炎免疫程序，這對乙型腦炎病毒疾病控制以及人類公共衛生方面有著重要意義。

[1] Burke D S,Tingpalapong M,Ward G S,etal.Intense transmission of Japanese encephalitis Virus to pigs in a region free of epidemic encephalitis [J].Southeast Asian J Trop Med Public Health，1985,16:199-206.

[2] Gajanana A，Rajendran R，Sanmuel P P,etal. Japanese encephalitis in south Arcot district,Tami Nadu,India:a three-year longitudinal study of vector abundance and infection frequency[J].Med Entomol ，1997.34:615-659.

[3] Kanojia P C,Shtty P S,Geevarghese G.A long-term Study on vector abundance & seasonal prevalence in relation to the occurrence of Japanese ence phalitis in Gorakhpur district,vttar Pradesh[J].Indian J Med Res ，2003.117:104-110.

[4] 楊培昌，曹興萍，高自壽，等.云南省楚雄州豬乙型腦炎流行情況血清學調查[J].動物醫學進展，2008，29(5) :109-112.

[5] 陳孝明，亓文寶，張桂紅，等.廣東省部分規模化豬場乙腦抗體的監測與分析[J].廣東農業科學，2010 (9) :154-155.

[6] 靳興軍，韓磊，紀蔚紅，等.北京市豬乙型腦炎血清流行病學調查[J].中國獸醫雜志，2008，44(8) :51-52.

[7] 魏燕鳴. 豬場蚊子中乙型腦炎病毒的RT-PCR檢測[J]. 湖北農業科學，2012, 51(14):3104-3106.

Study on the growth and decline of maternal antibody of Japanese encephalitis B virus and investigation of mosquito carrying virus

XIANG Wei-jun1, YANG Tao-tao1, LIU Hao2, LUO Ji-wei1, YU Xing-long1

(1.College of Veterinary Medicine , Hunan Agriculture University , Changsha 410128 , China ; 2.Changsha Animal Health Supervision Institute , Changsha 410013 , China)

To investigate the link between the dynamical changes of JEV in piglets and JEV in mosquitos. Twenty-four 15-day old piglets were selected and blood samples were collected 6 times every 20 days. Then, we used indirect ELISA method to detect serum antibody against JEV. At the same time, a total of 3720 mosquitos were trapped, and Japanese encephalitis virus nucleic acid was detected by RT-PCR. Results showed that the positive rate of antibody against Japanese encephalitis Bwas declined at the beginning and then increased. The positive rate for 83.6%, 83.3%, 66.7%, 41.6%, 25%, 50%, and 91.6%. The positive lowest rate was 25% in Aprilm and the highest positive rate was 91.6% in July. Of the 37 samples of mosquitos, 16 was JEV nucleic acid positive, and positive rate is as high as 43.2%. Of the 14 samples in July, 7 samples were positive, and the positive rate of JEV was 50%. These findings indicate that when mosquitoes are active in Japanese encephalitis epidemic season, the piglets haves, higher JEV antibody positive rate, suggesting a higher JEV infection rate.

Japanese encephalitis virus; Piglets; Antibody; mosquitoes

YU Xing-long

2016-08-21

國家自然科學基金(30972191)；吉林省留學人員創新創業項目(201523)；長春市農業先進實用技術的示范推廣項目(20130215)；農業部948項目(2014Z34)

向衛軍(1983-)，男，博士生，主要從事動物疾病發病機理及防控研究，E-mail:124068146@qq.com

通迅作者: 余興龍，E-mail:xlyu999@126.com

S852065+1

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0529-6005(2017)04-0027-03