黃芩苷對黏菌素致小鼠周圍神經毒性的保護作用研究

陸子音，連凱霞，李繼昌

(東北農業大學動物醫學學院 ，黑龍江哈爾濱150030)

黃芩苷對黏菌素致小鼠周圍神經毒性的保護作用研究

陸子音，連凱霞，李繼昌

(東北農業大學動物醫學學院 ，黑龍江哈爾濱150030)

黏菌素的神經毒性是眾所周知的。中藥黃芩苷具有抗氧化、保護神經等作用。本試驗通過設定正常組(生理鹽水)、模型組(靜脈注射15 mg/kg體重 黏菌素)、黃芩苷高劑量組(200 mg/kg體重 黃芩苷+15 mg/kg 黏菌素)、黃芩苷中劑量組(100 mg/kg體重黃芩苷+15 mg/kg 體重黏菌素)和黃芩苷低劑量組(50 mg/kg體重 黃芩苷+15 mg/kg 體重黏菌素)共5個劑量組，連續給藥7 d后，進行氧化-抗氧化相關生化指標測定(MDA、SOD、CAT和GSH)、坐骨神經組織中凋亡相關因子表達(Caspase3和Bax)及堿性髓鞘蛋白(myelin basic protein, Mbp)表達的測定。結果表明，黃芩苷干預組的小鼠氧化指標明顯降低，提高小鼠的抗氧化能力；Caspase3和Bax以及Mbp蛋白表達量均有降低。

黃芩苷 ； 黏菌素 ； 神經毒性

黏菌素是一類多黏芽孢桿菌亞種代謝所孕育的堿性肽多糖類抗生素[1]。抗菌譜較窄，只作用于革蘭陰性細菌[2 -3]。臨床上主要應用的黏菌素種類包括具有藥物活性的硫酸黏菌素和以非活性藥的形式存在的甲磺酸黏菌素。據報道，黏菌素是治療多重耐藥革蘭陰性細菌的有效藥物，但黏菌素潛在的神經毒性嚴重影響其臨床上的治療效果[4]。雖然神經毒性的發生幾率較之腎毒性小，但神經毒性的存在也嚴重危害黏菌素的臨床應用。

黃芩苷是從黃芩的干燥根提取的一種黃酮類化合物，具有多種藥理作用，如抗氧化、保護神經、抗腫瘤、鎮靜、抗病原微生物、免疫調節、抗炎癥、保肝利膽、抗過敏等。但目前對黃芩苷神經保護作用的研究主要集中在腦神經，尚未見其對黏菌素所致的周圍神經毒性的保護作用研究。

本試驗的目的主要是在已經建立起來的黏菌素神經毒性小鼠模型的基礎上，對小鼠應用不同劑量的黃芩苷進行干預，通過神經行為學、神經電生理、氧化抗氧化及蛋白免疫印跡等試驗方法來探討黃芩苷對黏菌素所誘導的神經毒性的保護作用及其作用機制的初探。

1 試驗材料

1.1 實驗動物 中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所實驗動物中心購買體重18～22 g雌性健康昆明系小鼠(許可證號：黑B2-20150878)。

1.2 主要試劑 黃芩苷提取物(舒泰神(北京)藥業有限公司)；硫酸黏菌素(colistin sulfate)谷胱甘肽(GSH)檢測試劑盒、總超氧化物歧化酶(T-SOD)檢測試劑盒、過氧化氫酶(CAT)檢測試劑盒、丙二醛(MDA)檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)；Western Blot組織裂解液；兔抗鼠anti-Caspase3單克隆抗體；兔抗鼠anti-Bax單克隆抗體；兔抗鼠anti-Mbp單克隆抗體。

2 試驗方法

2.1 實驗動物分組 健康昆明系小鼠在動物房正常環境條件下(溫度為25 ℃)，常規飼養1周。經過適應性飼養后，將其隨機分為5組，即正常組、模型組、黏菌素+黃芩苷低劑量組(50 mg/kg體重+15 mg/kg體重)、黏菌素+黃芩苷中劑量組(100 mg/kg體重+15 mg/kg體重)、黏菌素+黃芩苷高劑量組(200 mg/kg體重+15 mg/kg體重)。模型組：15 mg/kg體重(每天分兩次給藥)劑量的黏菌素靜脈注射；正常組：靜脈注射等量的生理鹽水；低劑量組：在黏菌素給藥前0.5 h對小鼠進行腹腔注射黃芩苷50 mg/kg體重；中劑量組：腹腔注射黃芩苷100 mg/kg 體重；高劑量組：腹腔注射黃芩苷200 mg/kg體重；7 d后，對小鼠進行剖殺，取血清及坐骨神經，進行氧化-抗氧化指標測定及線粒體凋亡相關蛋白表達。2.2 小鼠血清及坐骨神經中氧化-抗氧化指標的測定 SOD含量的測定將所用試管分為測定管和一支對照管，按表1順序加入所用試劑，對MDA、CAT及GSH含量的測定步驟同上。

表1 SOD含量的測定

充分混勻后，在室溫放置10 min，于波長550 nm處，1 cm光徑比色杯，蒸餾水調零，測定吸光度。

2.3 Western Blot檢測小鼠坐骨神經線粒體途徑凋亡相關蛋白表達 配置12% SDS-PAGE凝膠電泳分離膠，凝膠聚合后加入5%SDS-PAGE凝膠電泳積層膠。加入蛋白樣本進行電泳，恒壓80 V、40 min，樣本進入分離膠后電壓增加到120 V；120 V電壓將蛋白轉到PVDF膜上，1 h。TBS洗膜10 min后5%封閉液封閉1 h。封閉液稀釋一抗后4 ℃孵育過夜(1∶150 兔抗鼠Caspase3、1∶200 兔抗鼠Bax和1∶200兔抗鼠Mbp)；TBST洗膜后二抗孵育1 h(1∶5 000羊抗兔IgG二抗)，TBST洗膜3次10 min/次，ECL顯色。

3 數據處理

應用SPSS17.0軟件包，對數據進行單因素方差分析，差異顯著者再進行LSD檢驗。各組數據結果以平均數±S.D.表示，角標*及#表示兩組數值比較差異顯著(P<0.05)，角標**及##表示兩組數值比較差異極顯著(P<0.01)。

4 結果與分析

4.1 氧化-抗氧化試驗

4.1.1 血清氧化-抗氧化指標的測定 圖1可見，與對照組相比，模型組的血清生化指標中，氧化指標MDA的含量顯著升高，差異極顯著(P<0.01)，抗氧化指標SOD，GSH，CAT的含量顯著降低；與模型組相比，黃芩苷低、中劑量組小鼠的氧化指標MDA的含量有所降低，高劑量組小鼠血清中MDA含量降低，差異極顯著(P<0.01)；與模型組相比，抗氧化指標SOD，GSH，CAT的含量有不同程度的升高，高劑量組抗氧化指標大幅度升高，差異極顯著(P<0.01)。而黃芩苷低劑量組與模型組相比，氧化指標MDA的含量無顯著差異，抗氧化指標SOD，GSH，CAT的含量無顯著差異。

圖1 不同劑量的黃芩苷對黏菌素(15 mg/kg)處理的小鼠血清氧化-抗氧化指標的影響(n=10)A：正常組； B：模型組； C：黃芩苷低劑量組； D：黃芩苷中劑量組；E：黃芩苷高劑量組； **： P<0.01；##：P<0.01

4.1.2 坐骨神經中氧化-抗氧化指標的測定 由圖2可見，與對照組相比，模型組的坐骨神經組織中氧化指標MDA的含量顯著升高，差異極顯著(P<0.01)，抗氧化指標SOD，GSH，CAT的含量顯著降低，差異極顯著(P<0.01)；與模型組相比，黃芩苷高劑量組小鼠坐骨神經組織中氧化指標MDA的含量顯著降低，差異極顯著(P<0.01)，抗氧化指標SOD，GSH，CAT的含量顯著升高，差異極顯著(P<0.01)。

圖2 不同劑量的黃芩苷對黏菌素(15 mg/kg體重)處理的小鼠血清氧化-抗氧化指標的影響(n=10)A：正常組； B：模型組； C：黃芩苷低劑量組； D：黃芩苷中劑量組； E：黃芩苷高劑量組； **：P<0.01； ##：P<0.01

4.2 Western Blot檢測蛋白表達 Western Blot分析不同劑量的黃芩苷對黏菌素所導致的小鼠坐骨神經中Caspase3、Bax及Mbp蛋白的變化，見圖3。使用Image J軟件分析各蛋白表達水平，見圖4。結果發現，與正常組相比較，模型組的Caspase3、Bax蛋白表達量顯著升高(P<0.01)；與模型組相比較，黃芩苷低劑量組未見顯著區別；但黃芩苷中劑量組與模型組相比表達量降低，差異顯著(P<0.05)，高劑量組差異極顯著(P<0.01)。Mbp蛋白表達量的變化趨勢與Caspase3及Bax蛋白的表達量變化基本一致，模型組Mbp相對表達量與正常組相比較，顯著升高(P<0.01)；與模型組相比較，黃芩苷低、中劑量組均未見顯著區別；但黃芩苷高劑量組與模型組相比較Mbp表達量降低，差異極顯著(P<0.01)。

圖3 黃芩苷不同劑量作用下Caspase3、Bax及Mbp蛋白的相對表達量變化(n=10)

圖4 黃芩苷不同劑量作用下Caspase3、Bax和Mbp蛋白的相對表達量變化(n=10)**： P<0.01，與對照組相比； #： P<0.05，##： P<0.01，與模型組相比

5 討論

Caspases家族在凋亡信號轉導中起著核心作用。該家族一般分為兩類：由Caspase2，8，9和10構成的啟動式Caspases和由Caspases3, 6和7構成的效應式Caspase[8-9]。Caspase是調控凋亡的信號通路，并且是程序性死亡的主要代表蛋白。

Bax是Bcl-2家族中的促凋亡蛋白之一[10]，是最早發現的促凋亡因子，細胞質在亞細胞分級和免疫組織化學試驗均表明，Bax在正常細胞中多以非活性單體形式分布于細胞漿，部分附著于線粒體表面。當有凋亡信號刺激時，Bax蛋白被激活且分子結構發生改變，并移位到線粒體插入膜表面并形成孔道，導致膜內外離子及蛋白濃度的平衡紊亂，從而發揮線粒體依賴的促凋亡作用[11]。本試驗中，通過Western Blot試驗發現，模型組小鼠的坐骨神經中Bax蛋白表達量和Caspase3蛋白的含量明顯比正常組高(P<0.01)，這表明硫酸黏菌素可導致坐骨神經組織內Bax和Caspase3蛋白的顯著增加。Bax蛋白作為線粒體膜通透性改變的重要因素之一，同時它的表達量增加可促進其下游因子Caspase3的活化，啟動依賴Caspase凋亡的路徑，從而發揮線粒體依賴的促凋亡作用。由此可以推斷，當模型組小鼠靜脈注射硫酸黏菌素后，Bax含量的增加，開啟了Caspase3的凋亡途徑，凋亡現象加劇[12]。

Mbp是富含堿性氨基酸的強堿性膜蛋白，存在于哺乳動物神經系統中，在中樞神經系統中由少突膠質細胞合成和分泌；在周圍神經中，主要存在于周圍神經髓鞘中，由雪旺細胞合成與分泌。除了神經組織之外，Mbp在肝、肺及腎上腺等組織器官中的含量較低[13]。Mbp處于髓鞘螺旋化的致密部，與髓鞘膜上帶負電荷的脂質相互結合，保持髓鞘組織和功效的穩定性[14]。在成熟脊髓雪旺細胞上，Mbp是出現最晚的特異蛋白，并且在髓鞘的形成過程中具有啟動作用。在周圍神經損害時，Mbp水平的高低常能反應損害的程度。有研究表明，在周圍神經受損失時，Mbp表達量的高低主要反映了有髓纖維髓鞘的數量和完整程度[15]。本試驗結果顯示，模型組坐骨神經中Mbp的表達量顯著增加(P<0.01)，高于正常組的小鼠(即靜脈注射等量生理鹽水的小鼠)。由此我們得出，黏菌素所誘導的小鼠周圍神經毒性能導致坐骨神經中有髓神經纖維的數量減少，并且能破壞有髓神經纖維的完整性，導致坐骨神經脫髓鞘現象的產生，與本課題前期研究結果吻合[4]。

小鼠血清及坐骨神經組織中氧化-抗氧化指標檢測結果發現，黃芩苷低、中、高3個試驗組小鼠的氧化指標(MDA)活性與模型組對比有不同程度降低，同時試驗組小鼠抗氧化指標(SOD、CAT、GSH)的活性與模型組對比有所升高，并且黃芩苷高劑量組變化顯著(P<0.01)。這提示，黃芩苷能通過抗氧化作用明顯改善黏菌素所引起的小鼠氧化-抗氧化系統的紊亂，在一定程度上減少了神經損傷，從而起到保護作用，并具有劑量依賴性。

在Western Blot方法檢測Caspase3、Bax及Mbp，不同試驗組的小鼠坐骨神經中Caspase3和Bax蛋白表達量降低，與模型組比較，中、高劑量組小鼠體內坐骨神經中的Caspase3和Bax的表達均量顯著降低(P<0.01)，最終導致相應線粒體途徑的細胞凋亡的現象也會有不同程度的減少，也證實了黃芩苷具有保護坐骨神經免受神經毒的影響。與以上試驗結果保持一致。據此推斷，外源性黃芩苷進入機體后，可能通過抗氧化功能從而抑制神經細胞的凋亡相關信號通路，進而下調Caspase3和Bax的表達，通過調節線粒體信號通路，抵抗黏菌素對線粒體的損傷。Mbp活性量的高低主要反映了有髓纖維髓鞘的數量和完整程度。在黃芩苷預處理的試驗組中，Mbp表達量降低，當劑量達到200 mg/kg體重時，Mbp的相對表達量與模型組相比降低，差異極顯著。這一研究結果表明，黃芩苷能通過對抗黏菌素所誘導的小鼠坐骨神經脫髓鞘現象及增強坐骨神經有髓神經纖維的數量對神經起到保護作用。

6 結論

黃芩苷對黏菌素誘導的小鼠周圍神經毒性具有保護作用，并且在200 mg/kg體重的劑量下保護效果最佳。其機制可能與黃芩苷的抗氧化有關，且黃芩苷的保護作用具有劑量依賴性。

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Baicalin Protects Against Colistin-induced Peripheral Neuro Toxicity in Mice

LU Zi-yin, LIAN Kai-xia, LI Ji-chang

(Northeast Agricultural University College of Animal Medicine, Harbin 150030, China)

Colistin-induced neurotoxicity is well-known. Baicalin has a lot of pharmacological effects, such as antioxidation, neuro-protection, et al. In this Study,mice were divided into five dose groups: normal group (saline), model group (intravenous colistin 15 mg/kg), baicalin high dose group (200 mg/kg baicalin +15 mg/kg colistin), and baicalin media dose group (100 mg/kg baicalin+15 mg/kg colistin), baicalin low dose group (50 mg/kg baicalin +15 mg/kg colistin). After 7 days of administration, we measured the oxidation-antioxidant, expression of apoptosis-related factors (caspase3 and Bax) and myelin basic protein detection in sciatic nerve. The results showed that: baicalin significantly reduced reactivity of oxygen indicators and improved the anti-oxidative capacity The expression of Caspase3, Bax and Mbp proteins were significantly decreased by baicalin.

baicalin; colistin; neurotoxicity

LI Ji-chang

2016-06-15

國家自然科學基金(31472240)

陸子音(1988-)，女，博士生，主要研究方向為獸醫藥理學與毒理學，E-mail:luziyin0217@sina.com

李繼昌，E-mail：lijichang@neau.edu.cn

S852

A

0529-6005(2017)04-0013-04