鴨星狀病毒單克隆抗體的制備及鑒定

楊彬彬，王雨舟，郭 輝，張 冰，張大丙

(1. 中國農業大學動物醫學院，北京海淀100193 ； 2. 南開大學生命科學學院，天津南開300071)

鴨星狀病毒單克隆抗體的制備及鑒定

楊彬彬1，王雨舟2，郭 輝1，張 冰1，張大丙1

(1. 中國農業大學動物醫學院，北京海淀100193 ； 2. 南開大學生命科學學院，天津南開300071)

為了制備針對鴨星狀病毒(Duckastrovirus, DAstV)衣殼蛋白的單克隆抗體，以DAstV C-NGB株為免疫原，用ORF2重組蛋白作為抗原進行篩選，獲得7株穩定分泌抗DAstV ORF2蛋白單抗的雜交瘤細胞。取E5C1株和C10F6株進行鑒定，結果表明，2株單抗均為IgM，輕鏈均為κ型；細胞上清和小鼠腹水的效價分別為105和106以上；免疫印跡試驗表明，2株單抗均能識別重組ORF2蛋白；特異性試驗表明，E5C1株雜交瘤細胞的培養上清只與DAstV反應。

鴨星狀病毒 ； 單克隆抗體 ； ORF2蛋白

鴨病毒性肝炎(Duck viral hepatitis, DVH)是危害養鴨業的高度致死性傳染病，其病原包括小RNA病毒科禽肝病毒屬的鴨甲肝病毒和星狀病毒科禽星狀病毒屬的鴨星狀病毒(Duckastrovirus, DAstV)。其中，DAstV指歷史上所稱的鴨肝炎病毒血清2型和3型[1-7]。一般認為，僅英國和美國發生過DAstV感染引起的DVH[1-7]，而付余(2008)的研究結果表明，我國江蘇已出現由DAstV引起的DVH[8]。對基因組部分序列進行比較的結果表明，我國的DAstV毒株(C-NGB株)可能屬于鴨肝炎病毒血清2型[8]。迄今為止，DAstV的檢測方法仍十分缺乏。通常認為電鏡技術是診斷DAstV感染最可靠的診斷方法，但該法不適用于大量樣品的檢測。為建立快速的檢測方法，本研究以DAstV C-NGB株為材料，制備了針對衣殼蛋白的單克隆抗體。

1 材料與方法

1.1 毒株、細胞及實驗動物 DAstV C-NGB株、鴨甲肝病毒、鴨瘟病毒均由本實驗室保存，番鴨細小病毒、禽副黏病毒1型均由揚州大學獸醫學院王永坤教授惠贈，SP2/0細胞株由中國農業大學實驗動物所病毒室張國中教授惠贈；8周齡雌性BALB/c小鼠，購自軍事醫學科學院實驗動物中心。

1.2 主要試劑 純化的DAstV ORF2重組蛋白由本室制備并保存。HAT、HT選擇培養基，購自Sigma公司；DMEM高糖培養基、胎牛血清、二甲基亞砜，購自GIBCO BRL公司；Clonotyping System(5300-05)，購自Southern Biotech公司；HRP標記的山羊抗小鼠IgG、IgM，購自北京博奧森生物技術有限責任公司。

1.3 免疫原的制備 取DAstV C-NGB株病毒液，10 000 r/min (4℃)離心30 min，收集上清，在上清液中緩緩加入氯仿至40%，充分混勻后，置于4 ℃ 1 h，5 000 r/min離心20 min，取水相，10 000 r/min離心30 min，棄沉淀，再以25 000 r/min(4℃)離心3 h，收集上清，沉淀用1%原體積的10 mmol/L PBS緩沖液(pH值7.4)溶解，貯存于-80 ℃備用。

1.4 動物免疫 將抗原和弗氏完全佐劑等量混合，充分乳化，經頸背部皮下多點注射方式免疫8周齡BALB/c小鼠，此后，每隔2周，用加弗氏不完全佐劑的抗原進行加強免疫，共進行3次加強免疫，在進行脾細胞融合前3 d，用抗原液經腹腔再免疫1次。

1.5 間接ELISA檢測方法的建立 以ORF2重組蛋白作為包被抗原，首先通過方陣試驗確定抗原最佳包被濃度和陰陽性血清稀釋度，再按常規程序建立檢測抗體的間接ELISA，經酶標儀讀取OD450nm，選擇P/N值較大且陽性血清OD值在1左右、陰性血清OD值較低的條件為最佳條件。

1.6 雜交瘤細胞株的建立 選擇生長狀態好的SP2/0骨髓瘤細胞，與免疫鼠脾細胞按照1∶5的比例混合，以50% PEG4000為融合劑按常規方法進行融合。低速離心后，棄上清，用含20%血清和1%HAT的DMEM培養基重懸，加入鋪好飼養細胞的96孔板中，100 μL/孔，置37 ℃、5% CO2培養箱中培養，每日記錄生長情況。每隔2 d換液1次(換液量為50%)，2周后用含1%HT的DMEM培養基培養。待細胞克隆生長到覆蓋細胞孔底部1/4～1/3時，用間接ELISA法對上清進行檢測，采用有限稀釋法對強陽性細胞進行亞克隆。3次亞克隆后對穩定分泌抗體且效價高的雜交瘤細胞株進行擴增培養和凍存。挑選經產BALB/c小鼠，腹腔注射滅菌石蠟油，0.5 mL/只。14 d后，經腹腔注射雜交瘤細胞，106個/只。7～10 d后，取腹水，離心收集上清，置-80 ℃保存備用。

1.7 單克隆抗體的鑒定

1.7.1 雜交瘤細胞染色體計數 選擇生長狀態良好的雜交瘤細胞加入秋水仙素溶液，通過低滲處理、預固定、固定、再固定、制片和染色制備細胞染色體，在顯微鏡下計算染色體的數目，并照相記錄[10]。

1.7.2 亞類及輕鏈種類的鑒定 按照鼠單抗分型試劑盒介紹的操作步驟進行。

1.7.3 效價的測定 分別將雜交瘤細胞上清和小鼠腹水進行10倍系列稀釋，測定其ELISA效價。

1.7.4 免疫印記試驗 按常規方法進行SDS-PAGE。以1∶100稀釋的小鼠腹水為一抗，HRP標記的山羊抗小鼠IgM為二抗，進行Western Blot鑒定。

1.7.5 特異性試驗 用2 μg/mL ORF2重組蛋白為包被抗原，以HRP標記的山羊抗小鼠IgM為二抗，用間接ELISA檢測雜交瘤細胞培養上清與鴨星狀病病毒、鴨甲肝病病毒、鴨瘟病毒、番鴨細小病病毒和禽副黏病病毒1型的交叉反應性。

1.7.6 穩定性檢測 將雜交瘤細胞分別凍存3個月和6個月，進行復蘇培養，用間接ELISA檢測上清中的抗體效價。

2 結果

2.1 小鼠免疫抗體的檢測 用間接ELISA進行檢測的結果顯示，經4次免疫后，小鼠血清抗體效價達到1∶8 000以上，在最后一次免疫后3 d，取效價最高的小鼠脾細胞進行融合。

2.2 雜交瘤細胞篩選方法的建立 通過方陣法確定ORF2重組蛋白的最佳包被濃度為2 μg/mL，血清稀釋度為1∶800，最佳包被條件為4 ℃過夜，最佳封閉液為1%BSA，陰陽性臨界值為0.096。

2.3 雜交瘤細胞株的建立 融合后第3天可見有細胞克隆生長，1周后有雜交瘤細胞生長的孔占80%以上。用間接ELISA篩選出的強陽性細胞經3次亞克隆，得到7株雜交瘤細胞株，分別命名為E5C1、C10F6、A9D10、D3E1、E3G1、F10C7和G3H7。

2.4 單克隆抗體的鑒定

2.4.1 雜交瘤細胞染色體計數 BALB/c小鼠脾細胞染色體數為40條，SP2/0骨髓瘤細胞染色體數為60～70條。用10% Giemsa染液染色后，對E5C1株雜交瘤細胞染色體進行計數，平均值為100條。

2.4.2 亞類及輕鏈種類的鑒定 用Southern Biotech分型試劑盒鑒定，單克隆抗體E5C1和C10F6株均是IgM亞類，其輕鏈均為κ型。

2.4.3 效價的測定 用間接ELISA分別對雜交瘤細胞上清和小鼠腹水進行效價測定，2株單抗培養上清的效價為1∶105，腹水的效價為1∶106以上。

2.4.4 免疫印記試驗 Western Blotting結果顯示，單克隆抗體E5C1和C10F6株能特異性地識別52 kDa的DAstV ORF2重組蛋白(圖1)。

2.4.5 特異性試驗 E5C1株雜交瘤細胞培養上清與DAstV反應的OD值(1.328)明顯高于與鴨甲肝病毒、鴨瘟病毒、番鴨細小病毒、禽副黏病毒反應的OD值(0.081～0.158)。結果說明，E5C1株單抗可特異性識別DAstV。

2.4.6 穩定性檢測 將單克隆抗體E5C1株的雜交瘤細胞保存6個月后，經連續傳代培養，其上清中的抗體效價仍然大于1∶105。

圖1 兩株單克隆抗體與ORF2蛋白反應性的鑒定

1：C10F6； 2：E5C1； M：蛋白Marker

3 討論

迄今為止，DAstV的分離培養較為困難，本試驗采用純化的含毒組織研磨液作為免疫原免疫小鼠，以ORF2重組蛋白作為篩選抗原，既保證了免疫所需的病毒量，又便于篩選出衣殼蛋白的抗體，免疫印記試驗結果證實了該結果。

本試驗通過細胞融合技術、有限稀釋法獲得了7株雜交瘤細胞。在ELISA篩選過程中，為了避免菌體自身蛋白和His標簽蛋白的干擾，所有篩選的陽性克隆細胞培養上清都已用pET-32a(+)空載體表達產物進行了排除。對單克隆抗體E5C1和C10F6株進行鑒定的結果顯示，它們均屬IgM亞類，其輕鏈均為κ型，篩選出IgM型單抗可能與DAstV ORF2蛋白免疫機制有關。本研究結果為下一步研究ORF2蛋白的免疫保護機制奠定了基礎，同時為探索新的DAstV快速診斷方法提供一個新思路。

[1] Asplin F D.Duck hepatitis: vaccination against two serological types[J]. Vet Rec, 1965, 77(50): 1529-1530.

[2] Toth T E.Studise of an agent causing mortality among duckings immune to duck virus hepatitis[J]. Avian Dis, 1969, 13(4): 834-846.

[3] Haider S A, Calnek B W.In vitro isolation, propagation, and characterization of duck hepatitis virus type Ⅲ[J]. Avian Dis, 1979, 23(3): 715-729.

[4] Gough R E, Collins M S, Borland E D,etal.Astrovirus-like particles associated with hepatitis in ducklings[J]. Vet Rec, 1984, 114(11): 279.

[5] Gough R E, Borland E D, Keymer I F,etal.An outbreak of duck hepatitis type II in commercial ducks[J]. Avian Pathol, 1985, 14: 227-236.

[6] Fauquet C M, Mayo M A, Maniloff J,etal.Virus taxonomy.Eighth report of the international committee on taxonomy of viruses[J]. San Diego: Elsevier Academic Press, 2005, 859-864.

[7] Todd D, Smyth V J, Ball N W,etal. Identification of chicken enterovirus-like viruses, duck hepatitis virus (DHV) type 2 and DHV type 3 as astroviruses[J]. Avian Pathol, 2009, 38: 21-30.

[8] FuY, Pan M, Wang X,etal.Complete sequence of duck astrovirus associated with fatal hepatitis in ducking[J]. J Gen Virol, 2009, 90: 1104-1108.

[9] 薩姆布魯克J,拉塞爾D W.分子克隆實驗指南,黃培堂,王嘉璽,朱厚礎,等譯.3版[M].北京:科學出版社,2002.

[10] 薛慶善.體外培養的原理與技術[M].北京:科學出版社,2001:948.

Preparation andidentification of Monoclonal Antibodies against Duck Astrovirus

YANG Bin-bin1, WANG Yu-zhou2, GUO Hui1, ZHANG Bing1, ZHANG Da-bing1

(1.College of Veterinary Medicine, China Agricultural University, Beijing 100193, China; 2.College of Life Sciences, Nankai University, Tianjin 300071, China)

For preparing monoclonal antibodies (Abs) against duck astrovirus (DAstV) capsid protein, the DAstV C-NGB isolate was used as immunogen and the purified recombinant ORF2 protein as antigen to secreen specific antibodies. Seven hybridoma cell lines that stably secreted Abs against DAstV ORF2 were obtained. Two selected Abs, namely E5C1 and C10F6, were identified as IgM with light chains belonging to κ type. The titers of both Abs in cell culture supernatants and ascites were determined to be 1:105and 1:106， respectively. The reactions of the E5C1 and C10F6 Abs with the recombinant ORF2 protein were confirmed by Western Blotting. The E5C1Ab in culture supernatants was tested to react only with DAstV in specificity tests.

Duck astrovirus; Monoclonal antibody; ORF2 protein

s： ZHANG Da-bing； ZHANG Bing

2014-10-20

公益性行業(農業)專項經費(201003012)；現代農業產業技術體系專項資金(CARS-43)

楊彬彬(1986-)，女，碩士，研究方向為實驗動物學，E-mail：binbinyang1986@163.com

張大丙，E-mail：zdb@cau.edu.cn；張冰，E-mail：zhangdb@cau.edu.cn

S852.65+9.6

A

0529-6005(2017)04-0007-02