戊酸雌二醇對大鼠胎鼠睪丸及睪丸引帶的影響*

張 煒，林 虹，王玉蓮

(汕頭大學醫學院第一附屬醫院泌尿外科，廣東 汕頭 515041)

隱睪癥早產兒發病率約為30%，健康新生兒約為3%，3月時約為1%。隱睪時因睪丸長期留在腹腔內或腹股溝管里，受體內“高溫”的影響，容易造成男性不育[1]。在助孕治療領域中，體外受精-胚胎移植和冷凍胚胎移植中經常使用較大劑量的雌激素促進子宮內膜生長以利胚胎種植，一旦妊娠，持續用藥至妊娠12周胎盤功能建立后停藥，這就使早孕期處于器官分化發育關鍵時期的胚胎一直暴露在母體循環中的高雌激素環境[2-3]。研究顯示，雌激素樣化合物可直接作用于胚胎生殖器官和通過干擾內分泌系統，影響胚胎發育及性腺發育，幾乎可引起各種形式的雄性生殖系統發育障礙，睪丸小、無精子及尿中促性腺激素增高等統稱為睪丸發育不全綜合征[4-5]。本課題通過動物實驗，在早孕期給予大鼠戊酸雌二醇，建立高雌激素狀態的動物模型，觀察娩出的雄性子代出現睪丸發育不全綜合征的情況，觀察胎鼠睪丸及睪丸引帶外觀，生殖系統的使用功能和結構的影響,探究出睪丸下降不全的相關因素。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康、性成熟的SD大鼠40只,由廣東省實驗動物中心提供；其中雌性30只,雄性10只,體重180～230 g，喂養于實驗動物中心(SPF級)，室溫22℃～25℃ ,濕度40%～55%,晝夜周期為12/12 h。

1.2 動物模型的建立

大鼠合籠交配，每天早晚兩次檢查雌鼠有無出現陰道栓，并行陰道涂片，以陰道涂片顯微鏡下見到精子確定受孕，孕鼠隨機分配各組進行實驗。

根據醫學產品生殖毒性檢測指導原則，選擇早孕期大鼠給予戊酸雌二醇建立動物模型。受孕大鼠隨機分為4組：對照組、低劑量組(1.0 mg/kg )、中劑量組(1.5 mg/kg )和高劑量組(2.0 mg/kg )。以上共4組每組至少6只孕鼠,從孕鼠孕6～ 15 d每天1次連續灌胃給予戊酸雌二醇(法國LYS LEZLANNOY出品，進口藥品注冊證號:H20030177) ， 戊酸雌二醇溶解于生理鹽水1m，對照組給生理鹽水1 mL。孕鼠分娩的雄性子代，正常飼養至出生后60 d。處死各組雄性子鼠并取睪丸進行觀測。

1.3 標本采集及測量

摘取睪丸、附睪，電子天平稱重，計算臟器系數(睪丸或附睪重量/大鼠體重100)；睪丸放入10%甲醛液中固定24 h以上，常規石蠟包埋、切片、HE染色，在100光鏡下觀察生精小管的形態學變化，每只大鼠睪丸橫切面切片中隨機選取10個的生精小管測其直徑，圖像分析軟件Image-pro-plus 6.0進行手動選定測量，測量方法：生精小管直徑為過中心兩固有層外界之間的距離，生精上皮高度為基膜上界到生精小管生精上皮頂端的距離，取平均值用于分析睪丸發育情況。

根據在較高溫度下(32℃～ 35℃ ， 30 min )睪丸不能墜入陰囊判定為隱睪。隱睪評分：睪丸位于腹腔內：3分；腹股溝區：2分；皮下環處：1分；陰囊內：0分。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 存活率

對照組(A)娩雄性子代18只、低劑量組(B)娩雄性子代17只、中劑量組(C)娩雄性子代19只、高劑量組(D)娩雄性子代17只。各組仔鼠存活率較對照組差異無統計學意義(P>0.05)。

2.2 體重、附睪睪丸重量和臟器系數

雄性子代的體重、附睪睪丸重量和臟器系數中、高劑量組與對照組、低劑量組觀察比較，差異有統計學意義(P<0.05)，以高劑量組的系數為最低。見表1。

表1 對照組和低、中、高劑量組雄性子代的體重、附睪睪丸重量和臟器系數

2.3 各組的隱睪發生率

各組的隱睪發生率分別為5.5%(2/36)、35.8%(2/34)、34.2%(3/38)， 58.8%(20/34)；對照組、低劑量組兩組隱睪發生率對比，差異無統計學意義(P>0.05)，中、高劑量組組與對照組對比，有明顯差異，有統計學意義(P<0.05) ， 而中、高劑量組之間差異有顯著性(P>0.05)，高劑量組的發生率為最高。見表2。

表2 對照組和低、中、高劑量組雄性子代的隱睪評分

注：單雙側隱睪為例數。每側為雙側，故此表中除組別項，其他項例數翻倍。

3 討論

到現在,睪丸下降不全的的病因還不能確定，睪丸下降不全是指睪丸下降障礙，停留在下降過程的途中，未能進入陰囊[6]。臨床上也習慣稱為隱睪癥，是先天性疾病。睪丸下降不全的原因有很多，例如遺傳因素：有大多數人隱睪病人有家里遺傳的情況，所以遺傳也可能是睪丸下降不全的機制[7]。隱睪的發生可能還有其他的因素，跟隨著社會日新月異的進步，科學醫療水平都在日益的提高，一定會找出治療睪丸下降不全的有效方法，從而抑制隱睪這種疾病的發生；內分泌因素：睪丸的下降胎兒睪丸間質細胞產生雄激素是要靠母體的促性腺激素，假若促性腺激素不產生下降說明睪丸自身發育有缺陷，而促使隱睪[8-11]，因為血液中促性腺激素濃度非常高時睪丸下降發生，當母體本身缺少促性腺激素時，也會發生隱睪。器質性因素：導致隱睪的器質性因素主要有睪丸系帶很短或缺，如睪丸系膜發生粘連、精索的血管或輸精管太短、睪丸畸形發育以及陰囊發育不正常等[12]。雌激素的作用同樣需與其受體結合后方可發揮其生物效應，在Ivell、Raivio、Emmen、Shono等都發現了可誘發睪丸引帶發育遲緩改變， 可以會影響雄性生殖系統發育并且使正常內分泌功能紊亂，使泌尿生殖系統發生了畸形。

目前國內外對戊酸雌二醇安全用藥方面的研究主要集中在評價其作為避孕藥及絕經期激素替代治療方面，而對子宮內早期接觸戊酸雌二醇后對性成熟期雄性子代生育能力的影響較少關注,文獻僅見從致死率及畸形率來評價戊酸雌二醇的胚胎毒性，而未見評價子代成年后的生育能力。我們在本研究中發現戊酸雌二醇在早孕期注射低劑量未觀察到雄性子代的生殖系統發育有什么異樣，這與我們先前的研究結果基本一致。然而中劑量以及高劑量的戊酸雌二醇卻顯著引起隱睪的發生，其中、高劑量組雙側隱睪的發生率為29.4%(5/17)，為各組最高。中、高劑量組的隱睪評分均明顯升高，表明了外源性雌激素對雄性子代明顯影響睪丸的下降及發育，高劑量組隱睪下降不全程度最為嚴重[14-15]。我們推測： Insl3誘導的睪丸引帶細胞增生和阻止雄激素的促進顱側懸韌帶退化可以使用外源性雌激素將拮抗雄激素受體，阻止睪丸引帶經歷逐漸發育、生長擴張腹股溝管,隨后又逐漸縮短、退化,從而牽引睪丸下降的過程。

對子宮內激素環境的改變最明顯的是動物生殖系統。生殖系統發育有所改變是由于雄性動物在子宮內的外源性雌激素的暴露，而且雌激素活性物質對嚙齒動物生殖毒性的作用敏感性與特定的胚胎發育關鍵時間相關。Fisher等采用具有雌激素樣活性的鄰苯二甲酸酯(DBP)誘發的動物模型顯示：給妊娠期母鼠一定劑量的DBP后其不同日齡的雄性子代睪丸重量均明顯低于對照組，子代成年后約80%出現不育，睪丸發育不良。

附睪、睪丸的重量是這兩種器官的傳統的定量指標，而且睪丸重量與生殖細胞數量密切相關,睪丸重量及睪丸組織病理學效應對生育力有較大的預測價值。睪丸組織學方面其量化指標包括生精小管直徑和上皮高度， 就辨別生精損壞的程度來說，其價值要比睪丸重量測定要大。睪丸在受到毒物作用后，影響到生精過程,必然引起生精上皮細胞的退化，失去正常的生精相， 使上皮變薄，生精小管內精子減少或消失。睪丸的各種病理變化最終都造成生精小管的萎縮，因此，睪丸生精小管管腔直徑和上皮高度的變化，能在一定程度上反映睪丸的損傷情況[16]。

此次研究利用戊酸雌二醇提示睪丸質量有所改變，并且發現了有不同程度發育缺陷，發現組織結構排列紊亂，生精上皮層次變薄，曲細精管發生退行性變化，睪丸不能產生成熟的精子，并且支持細胞和生精細胞出也現了故障，從而得出了戊酸雌二醇能對睪丸的生精細胞成熟和細胞發育有很大影響。大量的戊酸雌二醇使睪丸中的Leydig細胞大量增多，而且睪丸間質組織產生增生。經過此次研究發現戊酸雌二醇影響T的合成和對AR受體的拮抗作用， 產生抗雄激素效應，通過下丘腦-垂體-性腺軸負反饋調節，導致睪丸Leydig細胞反應性增生。通過實驗里的各組各項指標與對照組對比，差異有統計學意義，證明外源性雌激素給藥對胎鼠性別和身體的發育沒有顯著的影響。

綜上所述，根據此次研究證明戊酸雌二醇能使大鼠睪丸下降出現問題，同時睪丸間質細胞的能力得到改變睪丸分泌睪酮降低。

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