無菌和帶菌松材線蟲對赤松的致病性*

林 麗 周 蕾 潘 珺 康李鵬 葉建仁 朱麗華

(南方現代林業協同創新中心 南京林業大學林學院 南京 210037)

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無菌和帶菌松材線蟲對赤松的致病性*

林 麗 周 蕾 潘 珺 康李鵬 葉建仁 朱麗華

(南方現代林業協同創新中心 南京林業大學林學院 南京 210037)

【目的】 探討無菌和帶菌松材線蟲對赤松的致病性，明確松材線蟲在松樹萎蔫病中的地位，為致病機制研究及病害防控提供依據。【方法】 以赤松胚性愈傷組織為材料，每塊組織接種無菌松材線蟲250條，培養12天后，利用2,3,5-三苯基氯化四氮唑(TTC)染色法對愈傷組織進行染色，分析無菌松材線蟲對赤松愈傷組織細胞活性的影響。以赤松組培苗和4年生盆栽實生苗為對象，每株接種無菌松材線蟲和帶菌松材線蟲(組培苗250條，4年生苗3 000條)，分別于18天和35天后統計2種類型線蟲接種所致松苗萎蔫率，并對植株體內線蟲進行再分離，分析2種類型松材線蟲對赤松幼苗的致病能力。【結果】 無菌松材線蟲接種導致赤松胚性愈傷組織嚴重水漬化，TTC染色為米黃色或淡粉色，證明愈傷組織已失去活性。無菌松材線蟲和帶菌松材線蟲接種均能導致赤松組培苗萎蔫，接種18天后，萎蔫率分別為70%和60%； 萎蔫植株中均可再分離到松材線蟲，其每株平均分別為599±567條和365+240條，二者差異顯著(P<0.01)。剩余外觀健康的赤松組培苗中也分離到線蟲，但數量較少(僅10～20條)。2種類型松材線蟲接種引起赤松盆栽苗同等程度的萎蔫，接種35天后的萎蔫率均達80%，無菌和帶菌松材線蟲致萎蔫植株中均可再分離到松材線蟲，其每株平均分別為34 733±34 162條和25 057±21 410條，但差異不顯著(P=0.508)。其余外觀尚健康的松苗也進行線蟲分離，2株接種無菌松材線蟲的植株體內線蟲分別為486條和22條； 接種帶菌松材線蟲的2株松苗中，1株分離到646條線蟲，另1株沒有分離到線蟲。【結論】 無菌和帶菌松材線蟲均對赤松具有致病性，松材線蟲是赤松萎蔫的直接原因，伴生細菌并非赤松萎蔫的必須因子。

松材線蟲病； 松材線蟲； 無菌； 致病性； 赤松

松材線蟲病又稱松樹萎蔫病(pine wilt disease)，是松樹的一種毀滅性病害。該病涉及寄主松樹、線蟲、天牛、真菌、細菌及環境等多個方面(Rorizetal.， 2011； Niuetal.， 2012)，迄今為止其致病機制尚未清楚，因此給該病害的防治工作帶來極大困難(楊寶君， 2002； 談家金等， 2003； 王敏敏等， 2006)。明確病原是進行病害防控的最基本問題，而松材線蟲病的病原迄今尚存在較大爭議。大多數學者認為松材線蟲(Bursaphelenchusxylophilus)是該病害的唯一病原(楊寶君， 2002； 葉建仁等， 2012)。由于松材線蟲種群大量增長前，感病寄主松樹已在生理和組織上出現變化，Oku等(1979)推測松材線蟲以外的因素參與病害發生發展過程。隨后，Oku(1980)提出松樹萎蔫與松材線蟲攜帶細菌的代謝產物有關。Kawazu等(1997； 1999)經過一系列研究提出該病的真正病原是松材線蟲攜帶的致病細菌。洪英娣等(2003)和Han等(2003)亦報道松苗萎蔫與線蟲種類無關，而是由線蟲伴生細菌的種類所決定。也有學者認為該病害是由松材線蟲及其伴生細菌引起的復合侵染性病害(郭道森等， 2000； 趙博光， 2004； 陳守常， 2010)。為了弄清松材線蟲在松樹萎蔫過程中的地位，本研究以赤松(Pinusdensiflora)胚性愈傷組織、赤松組培苗及赤松4年生盆栽苗為試驗材料，探討無菌松材線蟲的致病性。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試松材線蟲為強毒松材線蟲蟲株AMA3的近交系后代AMA3c1(本文稱帶菌松材線蟲)，使用前采用單異活體法培養，即培養于灰葡萄孢(Botrytiscinerea)上，4 ℃保存。無菌松材線蟲(代號為在帶菌蟲株前加BF，即BF AMA3c1)的制備及無菌檢驗參照朱麗華等(2011)的方法。

供試赤松胚性愈傷組織參照吳靜等(2015)的方法培養，于增殖培養基中生長14天后備用。

供試赤松組培苗的培養參照朱麗華等(2010)的方法，將外植體切成0.5～0.8 cm大小莖段，接種于GD+2 mg·L-16-BA+0.5 mg·L-1NAA培養基上，25 ℃條件下培養5周后，將外植體連同已分化的叢生芽轉移至添加0.5 mg·L-1活性炭的DCR培養基上生長，1個月后，將伸長的叢生芽單個切下，接種于DCR培養基上，每個月繼代1次，連續6個月，備用。

赤松4年生盆栽實生苗培養于南京林業大學南大山溫室，備用。

1.2 無菌松材線蟲對赤松愈傷組織的影響及愈傷組織的活力測定

無菌條件下將無菌松材線蟲懸浮液接種到生長良好的赤松愈傷組織上，每塊組織接種100 μL(約含250條線蟲)，共3皿(每皿6塊)，接種等量無菌水為對照(1皿)。接種后，將其置于25 ℃培養箱中暗培養，7天后觀察其形態變化。

接種12天后，參照劉華等(2001)的方法，利用2,3,5-三苯基氯化四氮唑(TTC)染色檢測愈傷組織活力，具體方法稍加改動。取0.1 g愈傷組織放入離心管中，加入0.1 mol·L-1磷酸二氫鈉(NaH2PO4)緩沖液(pH 7.0)和0.4%TTC溶液各0.5 mL，25 ℃暗培養，12 h后觀察其染色情況。

1.3 松材線蟲對赤松組培苗的致病力測定及線蟲再分離

赤松組培苗的接種采用截頂法，具體參照朱麗華等(2011)的方法。從超凈工作臺中將組培苗取出，截去頂端后，將其接種于新鮮培養基中，再將無菌小棉球置于傷口上，隨后將無菌松材線蟲和帶菌松材線蟲分別接種到棉球上，每蟲株接種赤松組培苗10株，接種量為每株250條，無菌水為對照。接種后，于28 ℃光照培養箱中培養，接種后第2天開始觀察松苗萎蔫情況，持續觀察18天，統計松苗枯萎率。枯萎率=枯萎數/接種數×100%。

接種18天后，將感病植株及健康植株取出，用剪刀將針葉和莖段剪成2～4 mm長短的小段，采用貝爾曼漏斗進行線蟲的再分離，24 h后收集線蟲至離心管中，離心去上清后保留1 mL，顯微鏡下統計線蟲數量。其中，無菌線蟲接種植株體內線蟲的再分離于無菌條件下完成，并對所分離線蟲進行無菌檢測，以檢驗接種過程是否污染細菌，檢驗條件參照朱麗華等(2011)的方法。

1.4 松材線蟲對溫室赤松盆栽實生苗的致病力測定及線蟲再分離

赤松4年生盆栽實生苗致病力測定采用皮接法(張治宇等， 2002)，將無菌松材線蟲和帶菌松材線蟲分別接種于傷口處的棉球上，每蟲株接種赤松苗10株，接種量為每株3 000條，無菌水為對照。接種后，于28 ℃溫室條件下培養，觀察松苗發病情況，統計松苗枯萎率。

接種5周后，對所有植株分別進行線蟲分離。將植株從基部剪斷，針葉與枝條分開后，用剪刀將枝條剪成長度為5～6 mm小段，采用貝爾曼漏斗進行線蟲分離，24 h后將線蟲收集至離心管中，離心去上清后保留1 mL，顯微鏡下統計線蟲數量。

1.5 數據統計與分析

處理數據采用SPSS軟件進行統計和分析。

2 結果與分析

2.1 無菌松材線蟲對赤松胚性愈傷組織的影響

赤松胚性愈傷組織接種無菌松材線蟲(BF AMA3c1)后，未發現明顯褐變現象，但水漬化現象嚴重。接種7天后，愈傷組織水漬化程度達100%(圖1A)，而接種無菌水的對照愈傷組織依然呈緊密的團塊狀，表面顆粒狀，生長正常(圖1B)。接種無菌松材線蟲12天后的愈傷組織經TTC染色后呈現米黃色或淡粉色，表明愈傷組織已喪失活力或活力極弱(顯色越淡，活力越弱)； 而對照愈傷組織呈鮮艷的紅色，表明其活力很強(圖1C)。

2.2 松材線蟲對赤松組培苗的致病性

接種5天后，開始觀察到針葉褪色、黃化，最后枯萎變成紅褐色，無菌松材線蟲和帶菌松材線蟲所接種赤松苗的萎蔫癥狀一致，18天后，接種無菌松材線蟲及帶菌松材線蟲的赤松組培苗致萎率分別達70%和60%(表1)，接種無菌水的赤松組培苗始終保持健康狀態(圖2)。

線蟲再分離結果表明，無菌松材線蟲和有菌松材線蟲接種發病的赤松組培苗中均分離到線蟲。其中無菌松材線蟲接種萎蔫的每株松苗中線蟲平均為599±567條，經牛肉膏蛋白胨液體培養基檢驗72 h后未發現有任何細菌生長； 帶菌松材線蟲接種致萎的每株松苗中線蟲平均為365±240條(表1)。剩余外觀健康的赤松組培苗中也分離到線蟲，但數量較少，為10～20條。

2.3 松材線蟲對赤松4年生盆栽實生苗的的致病性

溫室接種試驗表明，無菌松材線蟲及帶菌松材線蟲均能使赤松4年生盆栽實生苗發病，接種5周后，2種類型線蟲的致萎率均達80%(表2)，且所致萎蔫癥狀一致，均為針葉先褪色、黃化，進而枯萎變成紅褐色，而對照松苗針葉依然保持健康的綠色(圖3)。

表1 赤松組培苗接種松材線蟲的萎蔫率及再分離線蟲數量(接種18天后)①Tab.1 Wilting ratios of tissue-cultured shoots of P. densiflora inoculated with aseptic and non-aseptic pine wood nematode and number of nematodes recovered(18 d after inoculation)

① 數值表示平均值±標準誤，不同字母表示差異顯著，t檢驗(P< 0.01)。Values represent the mean ± SD. Different letters are significantly different according tottest (P< 0.01). N代表此處未研究。 “N” means not done.下同。The same below.

表2 赤松4年生盆栽苗接種松材線蟲的萎蔫率及再分離線蟲數量(接種后35天)Tab.2 Wilting ratios of 4-year-old P. densiflora seedlings inoculated with aseptic and non-aseptic pine wood nematode and number of nematodes recovered(35 d after inoculation)

圖1 無菌松材線蟲對赤松胚性愈傷組織活力的影響Fig.1 Effect of aseptic pine wood nematode on the viability of the embryogenic calli of P. densifloraA. 接種無菌松材線蟲的赤松胚性愈傷組織(7天后)； B. 接種無菌水的赤松胚性愈傷組織(第7天)； C. 接種無菌松材線蟲12天后愈傷組織TTC染色結果(前3管為接種無菌松材線蟲的愈傷組織，后3管為對照)。A. Embryogenic calli inoculated with aseptic pine wood nematode(7 d later); B. Embryogenic calli inoculated with non-aseptic pine wood nematode(7 d later); C. Embryogenic calli staining with TTC solution(the first three tubes were aseptic PWNs inoculation and the last three tubes were CK).

圖2 接種無菌松材線蟲和帶菌松材線蟲對赤松組培苗的影響Fig.2 Symptoms of tissue-cultrued shoots of P. densiflora after inoculated with aseptic and non-aseptic pine wood nematodes上排： 接種1天后。Up： 1 d after inoculation； 下排： 接種18天后。Down： 18 d after inoculation.A. 無菌松材線蟲; B. 帶菌松材線蟲; C. 對照(無菌水)。A. Aseptic pine wood nematode; B. Non-aseptic pine wood nematode; C. CK(sterile water).

圖3 接種無菌松材線蟲、帶菌松材線蟲對赤松盆栽實生苗的影響Fig.3 Symptoms of potted seedlings of P.densiflora after inoculated with aseptic and non-aseptic pine wood nematodes

線蟲再分離表明，2類線蟲接種萎蔫的赤松苗體內均能再分離到松材線蟲，其數量差異不顯著，其中無菌線蟲接種萎蔫植株平均每株線蟲為34 733±34 162條，帶菌線蟲接種萎蔫植株平均每株線蟲為25 057±21 410條(表2)。對其余外觀尚健康的松苗也進行線蟲分離，2株接種無菌松材線蟲的健康植株體內線蟲分別為486條和22條； 接種帶菌松材線蟲的2株松苗中，1株分離到646條線蟲，1株沒有分離到線蟲。

3 討論

松材線蟲病是涉及多個因素的復雜病害，關于該病害的病原國際上存在較大爭議。各國學者采用多種寄主材料對松材線蟲及其攜帶細菌在松樹萎蔫中的作用進行探討。郭道森等(2001)和洪英娣等(2003)曾利用愈傷組織驗證細菌與松材線蟲病的關系，發現無菌松材線蟲接種不造成愈傷組織褐變，而攜帶細菌的線蟲可導致愈傷組織褐變，因此認為松材線蟲所攜帶細菌在病害發生過程中起至關重要的作用。由于植物愈傷組織對培養基成分、激素種類及含量、pH值等要求比較嚴格，條件稍有變化，常容易引起褐變壞死，很難區別其褐變壞死是由于細菌分泌的毒素所致，還是因為細菌分泌了某些物質引起培養條件改變所致。Tamura(1983)利用無菌赤松苗進行試驗，發現無菌松材線蟲單獨接種能使松苗萎蔫，Zhu (2012)和Faria (2015)等進一步證實Tamura的結果； 而Kawazu等(1997)、Zhao (2003)、洪英娣等(2003)以及Han (2003)等卻得到相反的結果，即無菌化處理使松材線蟲失去致病性。Bolla (1982)和Zhao (2013)溫室條件下的接種試驗結果顯示，無菌松材線蟲能使松苗萎蔫，而Zhao (2003)、池樹友等(2006； 2008)和談家金等(2008)的試驗結果與之相反。

4 結論

本研究利用赤松胚性愈傷組織、赤松組培苗以及溫室赤松盆栽實生苗為材料，在完全無菌和開放的環境條件下，證明無菌松材線蟲和帶菌松材線蟲一樣，均具有致病性。無菌松材線蟲接種赤松愈傷組織7天后，導致其水漬化現象嚴重； 接種12天后，赤松愈傷組織雖然未明顯褐變，但TTC染色顯示愈傷組織已完全失去活性或活性極低，從細胞水平證實無菌松材線蟲接種對寄主細胞造成極大影響甚至死亡。無菌松材線蟲與帶菌松材線蟲接種均可致赤松組培苗萎蔫，且萎蔫率相當； 2類線蟲致萎蔫植株體內均再分離到松材線蟲，無菌松材線蟲接種萎蔫植株中分離到的線蟲數量顯著高于帶菌線蟲接種植株，且無菌檢驗證實無菌接種過程未感染任何細菌，進一步證實無菌化處理并未使松材線蟲失去致病性。在溫室開放環境中，無菌及帶菌松材線蟲接種同樣導致赤松4年生盆栽實生苗萎蔫枯死，且致萎蔫率相當，說明無菌化處理后的松材線蟲依然保持其致病性。線蟲再分離結果顯示，在2種類型松材線蟲接種致萎蔫的植株中均分離到松材線蟲，帶菌線蟲接種植株體內再分離到的線蟲數量相對較少，但與無菌線蟲接種植株體內再分離線蟲數量差異不顯著。此外，對針葉也進行了分離(結果未列出)，其中，無菌線蟲接種萎蔫植株的針葉中，有6株分離到線蟲，數量7～1 000條不等； 而帶菌線蟲接種萎蔫植株的針葉中，有5株分離到線蟲，數量相對較少，僅3～50條。溫室條件下的接種試驗再次驗證松材線蟲能單獨導致松苗萎蔫。因此，松材線蟲是導致赤松萎蔫的的直接原因。

陳守常.2010.松材線蟲病病原與致病機理研究進展.四川林業科技,31(1)： 18-25.

(Chen S C. 2010. Advance in researches on of pathogens and pathogenenic mechanism of pine wood nematode disease. Journal of Sichuan Forestry Science and Technology, 31(1)： 18-25. [in Chinese])

池樹友,韓正敏,何月秋.2006.無菌松材線蟲對10年生黑松致病性的研究.林業科學,42(10)： 71-73.

(Chi S Y, Han Z M, He Y Q. 2006. Studies on the pathogenicity of 10 years old black pine inoculated with aseptic pine wood nematode. Scientia Silvae Sinicae, 42 (10)： 71-73. [in Chinese])

池樹友,何月秋,韓正敏,等.2008.松材線蟲及攜帶細菌對黑松復合的侵染.福建林學院學報,28(1)： 92-96.

(Chi S Y, He Y Q, Han Z M,etal. 2008. Studies on complex infecting of pine wood nematodes and the bacterium carried by it. Journal of Fujian College of Forestry, 28 (1)： 92-96. [in Chinese])

郭道森,趙博光,高 蓉.2001.利用愈傷組織驗證細菌分離物B619與松材線蟲病的關系.南京林業大學學報：自然科學版,25(5)： 71-74.

(Guo D S, Zhao B G, Gao R. 2001. Experiments on the relationship between the bacterium isolate B619 and the pine wilt disease by using calli ofPinusthunbergii. Journal of Nanjing Forestry University:Natural Science Edition, 25(5)： 71-74. [in Chinese])

郭道森,趙博光,高 蓉,等.2000.細菌分離物B619與松材線蟲病關系的初步研究.南京林業大學學報:自然科學版,24(4)： 72-74.

(Guo D S, Zhao B G, Gao R,etal. 2000. A preliminary study on the relationship between the bacterium isolate B619 and pine wilt disease. Journal of Nanjing Forestry University:Natural Science Edition, 24(4)： 72-74. [in Chinese])

洪英娣,趙博光,曹 越. 2003.松材線蟲攜帶細菌的致病性.南京林業大學學報： 自然科學版,27(2)： 45-48.

(Hong Y D, Zhao B G, Cao Y. 2003. Pathogenicity of bacteria carried by pine wood nematodes. Journal of Nanjing Forestry University： Natural Sciences Edition, 27(2)： 45-48. [in Chinese])

劉 華,梅興國.2001.TTC法測定紅豆杉細胞活力.植物生理學通訊,37(6)： 573-539.

(Liu H, Mei X G. 2001. Examining cell viability ofTaxuschinensiswith TTC (2,3,5-triphenyl-2H-tet-razolium chloride). Plant Physiology Communications, 37(6)： 573-539. [in Chinese])

談家金,向紅瓊,馮志新. 2008.松材線蟲伴生細菌的分離鑒定及其致病性.林業科技開發,22(2)： 23-26.

(Tan J J, Xiang H Q, Feng Z X. 2008. A preliminary study on isolation, identification and pathogenicity of the bacterium accompanyingBursaphelenchusxylophilus. China Forestry Science and Technology, 22(2)： 23-26. [in Chinese])

談家金，葉建仁.2003.松材線蟲致病機理的研究進展.華中農業大學學報，22(6)： 613-617.

(Tan J J, Ye J R. 2003. Advance in research of pathogenetic mechanism of pine wood nematode. Journal of Huazhong Agricultural University, 22(6)： 613-617.[in Chinese])

王敏敏,葉建仁,潘宏陽. 2006.松材線蟲病致病機理和防治技術研究進展.南京林業大學學報： 自然科學版,30(2)： 103-107.

(Wang M M, Ye J R, Pan H Y. 2006. Research advances of pathogenic mechanism and controlling technology for pine wood nematode disease. Journal of Nanjing Forestry University： Natural Sciences Edition, 30(2)： 103-107. [in Chinese])

吳 靜,朱麗華,許建秀,等.2015.抗松材線蟲病赤松胚性愈傷組織的誘導及增殖.南京林業大學學報： 自然科學版,39(1)： 17-21.

(Wu J, Zhu L H, Xu J X,etal. 2015. Inductionand proliferation of embryogenic callus in nematode-resistantPinusdensiflora. Journal of Nanjing Forestry University： Natural Sciences Edition, 39(1)： 17-21. [in Chinese])

楊寶君.2002.松材線蟲病致病機理的研究進展.中國森林病蟲,21(1)： 27-31.

(Yang B J. 2002. Advance in research of pathogenetic mechanism of pine wood nematode. Forest Pest and Disease, 21(1)： 27-31.[in Chinese])

葉建仁,黃 麟.2012.松材線蟲病病原學研究的幾個問題.中國森林病蟲,31(5)： 13-21.

(Ye J R, Huang L. 2012. Some aspects of the pathogen of the pine wilt disease. Forest Pest and Disease, 31(5)： 13-21.[in Chinese])

張治宇, 張克云, 林茂松, 等. 2002. 不同松材線蟲群體對黑松的致病性測定. 南京農業大學學報, 25(2)： 43-46.

(Zhang Z Y, Zhang K Y, Lin M S,etal. 2002. Pathogenicity determination ofBursaphelenchusxylophilusisolates toPinusthunbergii. Journal of Nanjing Agricultural University, 25(2)： 43-46.[in Chinese])

趙博光,郭道森.2004.松材線蟲攜帶的一株細菌分離及其致病性.北京林業大學學報,26(1)： 57-61.

(Zhao B G, Guo D S. 2004. Isolation and pathogenicity of a bacterium strain carried by pine wood nematode. Journal of Beijing Forestry University, 26(1)： 57-61. [in Chinese])

朱麗華,季錦衣,吳小芹,等.2011.一種制備無菌線蟲的方法.東北林業大學學報,39(6)： 65-67.

(Zhu L H, Ji J Y, Wu X Q,etal. 2011. A method for obtaining aseptic pine wood nematode. Journal of Northeast Forestry University, 39(6)： 65-67. [in Chinese])

朱麗華，吳小芹，戴培培，等.2010.赤松離體培養植株再生體系的建立.南京林業大學學報： 自然科學版，34(2)： 11-14.

(Zhu L H, Wu X Q, Dai P P,etal. 2010. In vitro plantlet regeneration from seedling explants ofPinusdensiflora. Journal of Nanjing Forestry University： Natural Sciences Edition, 34(2)： 11-14. [in Chinese])

Bolla I, Jordan W. 1982. Cultivation of the pine wilt nematode,Bursaphelenchusxylophilus, in axenic culture media. Journal of Nematology, 14(3)： 377-381.

Faria J M, Sena I, da Silva I V,etal. 2015. In vitro co-cultures ofPinuspinasterwithBursaphelenchusxylophilus： a biotechnological approach to study pine wilt disease. Planta, 241(6)： 1325-1336.

Han Z M, Hong Y D, Zhao B G. 2003. A study on pathogenicity of bacteria carried by pine wood nematodes. J Phytopathol, 151(11/12)： 683-689.

Kawazu K, Kaneko N. 1997. Asepsis of the pine wood nematode isolate OKD-3 causes it to lose its pathogenicity. Jpn Nematology, 27(2)： 76-80.

Kawazu K, Kaneko N, Hiranka K. 1999. Reisolation of the pathogens from wilted red pine seedlings inoculated with the bacterium-carrying nematode isolates. Scientific Reports of Faculty of Agriculture, Okayama University,88： 1-5.

Niu H T, Zhao L, Lu M,etal. 2012. The ratio and concentration of two monoterpenes mediate fecundity of the pinewood nematode and growth of its associated fungi. PLoS ONE, 7(2)： e31716.doi： 10.1371/journal.pone.0031716.

Oku H, Shiraishi T, Kurozumi S. 1979. Participation of toxin in wilting of Japanese pines caused by a nematode. Naturwissenschaften, 66(4)： 210.

Oku H. 1980. Pine wilt toxin, the metabolite of a bacterium associated with a nematode. Naturwissenschaften, 67(4)： 198-199.

Roriz M, Santos C, Vasconcelos M W. 2011. Population dynamics of bacteria associated with different strains of the pine wood nematodeBursaphelenchusxylophilusafter inoculation in maritime pine (Pinuspinaster). Experimental Parasitology, 128(4)： 357-364.

Tamura H. 1983. Pathogenicity of asepticBursaphelenchusxylophilusand associated bacteria to pine seedlings. Jpn Nematology, 13： 1-5.

Zhao B G, Wang H L, Han S F,etal. 2003. Distribution and pathogenicity of bacteria species carried byBursaphelenchusxylophilusin China. Nematology, 5(6)： 899-906.

Zhao H, Chen C, Liu S,etal. 2013. AsepticBursaphelenchusxylophilusdoes not reduce the mortality of young pine tree. Forest Pathology, 43(6)： 444-454.

Zhu L H, Ye J, Negi S,etal. 2012. Pathogenicity of asepticBursaphelenchusxylophilus. PLoS ONE, 7(5)： e38095.doi： 10.1371/journal.pone.0038095.

(責任編輯 王艷娜 郭廣榮)

Pathogenicity of Aseptic and Germ-CarryingBursaphelenchusxylophilusonPinusdensiflora

Lin Li Zhou Lei Pan Jun Kang Lipeng Ye Jianren Zhu Lihua

(Co-Innovation Center for Sustainable Forestry in Southern China College of Forestry, Nanjing Forestry University Nanjing 210037)

【Objective】The aim of this study is to explore the pathogenicity of asepticBursaphelenchusxylophilus(pine wood nematode, PWN) and non-aseptic PWN onPinusdensiflora, to better understand the role of PWN in pine wilt disease development, and to provide useful information on pathogenicity mechanism and disease control. 【Method】 The embryogenic calli ofP.densiflorawere inoculated with aseptic PWNs under aseptic conditions and cultured for 5 days. The effect of aseptic PWNs on the activity of embryogenic callus cells were evaluated by staining the embryogenic calli with the triphenyltetrazoliumchloride (TTC) solution. Tissue-cultured microshoots and 4-year-old seedlings cultured in green house were inoculated with aseptic PWNs and non-aseptic PWNs, respectively. In 18 and 35 days after inoculation, the pine wilt ratio was recorded and the PWNs were isolated from inoculated seedlings. The pathogenicity of aseptic PWN and non-aseptic PWN onP.densiflorawas analyzed. 【Result】The inoculation by aseptic PWNs caused severe water stain in embryogenic calli ofP.densiflora, and the TTC assay showed beige/light pink of embryogenic calli, revealing that the embryogenic cells lost viability. The embryogenic calli of control treatment remained healthy and showed bright red in TTC assay. Both the aseptic PWN and non-aseptic PWN wilted the tissue-cultured microshoots ofP.densiflora. The wilting rates of the microshoots were 70% and 60% in 18 days after inoculation with aseptic PWNs and non-aseptic PWNs, respectively. PWNs were recovered from all wilted microshoots with average number of PWNs 599+567/microshoot for aseptic PWNs inoculation and 365+240/microshoot for non-aseptic PWNs. The number of nematodes recovered from wilted microshoots showed significant difference (P< 0.01) between aseptic PWN and non-aseptic PWN treatments. Fewer PWNs (10-20/microshoot) were also recovered from the remaining healthy-looking microshoots. The aseptic PWN could induce wilting of potted-seedlings ofP.densiflora, as the same as non-aseptic PWN, with average of 80% wilting ratio in 35 days after inoculations. PWNs were recovered from wilted seedlings in both treatments. The number of recovered PWNs per seedling was 34 733±34 162 and 25 057±21 410 for aseptic PWNs and non-aseptic PWNs inoculations, respectively. No significant difference was found in number of recovered PWNs between the two treatments (P= 0.508). The number of recovered PWNs in two healthy-looking seedlings of aseptic PWNs treatment was 486 and 22, while only one healthy-looking seedlings of non-aseptic PWNs treatment contained 646 PWNs. 【Conclusion】 The aseptic and non-aseptic PWN could cause wilting ofP.densiflora. The PWN is the main factor causing wilt of Japanese red pine, while the bacteria carried by the PWN are not necessary for the development of PWD.

pine wilt disease;Bursaphelenchusxylophilus; asepsis; pathogenicity;Pinusdensiflora

10.11707/j.1001-7488.20170510

2016-09-23；

2016-12-11。

江蘇省高校自然科學研究重大項目(15KJA220003)； 江蘇高校優勢學科建設工程資助項目(PAPD)。

S763.11

A

1001-7488(2017)05-0082-06

*朱麗華為通訊作者。