TGFβR3基因3’UTR雙熒光素酶報告載體的構建及其與miR-let-7a靶向關系的驗證

周歡棟，顧睿，吳大洲，陳肖鳴

（溫州醫科大學附屬第一醫院 小兒外科，浙江 溫州 325015）

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TGFβR3基因3’UTR雙熒光素酶報告載體的構建及其與miR-let-7a靶向關系的驗證

周歡棟，顧睿，吳大洲，陳肖鳴

（溫州醫科大學附屬第一醫院 小兒外科，浙江 溫州 325015）

目的：構建 III型轉化生長因子β受體（TGFβR3）基因3’非編碼區（3’UTR）雙熒光素酶報告載體，并分析其與miR-let-7a的靶向關系。方法：根據microRNA靶基因預測軟件targetscan獲取miR-let-7a與TGFβR3基因3’UTR潛在的互補結合位點；PCR擴增出TGFβR3基因3’UTR序列并克隆至pGEM-T載體，定點突變潛在互補結合位點后雙酶切pGEM-T載體獲取目的片段并插入至雙熒光素酶報告載體獲得野生型和突變型重組雙熒光素酶報告載體，測序鑒定；將2種載體分別與miR-let-7a mimics或miR-let-7a NC共同轉染HEK293T細胞，收集細胞后通過雙熒光素酶報告系統檢測各組熒光素酶活性。結果：經測序鑒定成功構建野生型和突變型重組熒光素酶報告載體。雙熒光素酶報告系統檢測顯示，共轉染miR-let-7a mimics和野生型雙熒光素酶報告載體的熒光素酶活性比miR-let-7a NC組明顯降低（P＜0.05），而共轉染突變型雙熒光素酶報告載體后其熒光素酶活性差異無統計學意義（P＞0.05）。結論：成功構建TGFβR3基因3’UTR雙熒光素酶報告載體，并證實TGFβR3基因是新發現的miR-let-7a直接靶向調控基因。

mioroRNAs；miR-let-7a； III型轉化生長因子β受體；雙熒光素酶報告載體

microRNA let-7a（miR-let-7a）是最早發現以及目前研究最廣泛的microRNA之一，它通過與靶基因mRNA的3’非編碼區（3’untranslated region，3’UTR）特異性結合，從而降解靶基因mRNA或者抑制靶基因mRNA的翻譯過程[1]。miR-let-7a在細胞分化、增殖、凋亡、侵襲和遷移等多種生物學功能中發揮重要作用[2-4]，從而參與調節腫瘤[5]、炎癥[6]、心血管[7]等人類疾病的發生發展。……