TGFβR3基因3’UTR雙熒光素酶報告載體的構建及其與miR-let-7a靶向關系的驗證

周歡棟，顧睿，吳大洲，陳肖鳴

（溫州醫科大學附屬第一醫院 小兒外科，浙江 溫州 325015）

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TGFβR3基因3’UTR雙熒光素酶報告載體的構建及其與miR-let-7a靶向關系的驗證

周歡棟，顧睿，吳大洲，陳肖鳴

（溫州醫科大學附屬第一醫院 小兒外科，浙江 溫州 325015）

目的：構建 III型轉化生長因子β受體（TGFβR3）基因3’非編碼區（3’UTR）雙熒光素酶報告載體，并分析其與miR-let-7a的靶向關系。方法：根據microRNA靶基因預測軟件targetscan獲取miR-let-7a與TGFβR3基因3’UTR潛在的互補結合位點；PCR擴增出TGFβR3基因3’UTR序列并克隆至pGEM-T載體，定點突變潛在互補結合位點后雙酶切pGEM-T載體獲取目的片段并插入至雙熒光素酶報告載體獲得野生型和突變型重組雙熒光素酶報告載體，測序鑒定；將2種載體分別與miR-let-7a mimics或miR-let-7a NC共同轉染HEK293T細胞，收集細胞后通過雙熒光素酶報告系統檢測各組熒光素酶活性。結果：經測序鑒定成功構建野生型和突變型重組熒光素酶報告載體。雙熒光素酶報告系統檢測顯示，共轉染miR-let-7a mimics和野生型雙熒光素酶報告載體的熒光素酶活性比miR-let-7a NC組明顯降低（P＜0.05），而共轉染突變型雙熒光素酶報告載體后其熒光素酶活性差異無統計學意義（P＞0.05）。結論：成功構建TGFβR3基因3’UTR雙熒光素酶報告載體，并證實TGFβR3基因是新發現的miR-let-7a直接靶向調控基因。

mioroRNAs；miR-let-7a； III型轉化生長因子β受體；雙熒光素酶報告載體

microRNA let-7a（miR-let-7a）是最早發現以及目前研究最廣泛的microRNA之一，它通過與靶基因mRNA的3’非編碼區（3’untranslated region，3’UTR）特異性結合，從而降解靶基因mRNA或者抑制靶基因mRNA的翻譯過程[1]。miR-let-7a在細胞分化、增殖、凋亡、侵襲和遷移等多種生物學功能中發揮重要作用[2-4]，從而參與調節腫瘤[5]、炎癥[6]、心血管[7]等人類疾病的發生發展。尤其在腫瘤中，miR-let-7a被證實具有抑癌作用[8]，并在乳腺癌、結腸癌、肺癌等多種疾病中處于低表達狀態[9-10]。根據microRNA的作用機理，本研究經microRNA靶基因預測工具篩選分析發現， III型轉化生長因子β受體（transforming growth factor beta receptor 3，TGFβR3）是miR-let-7a直接靶向調控的潛在靶基因之一，而TGFβR3是TGF-β受體的一種亞型，可以抑制腫瘤細胞的增殖、遷移、侵襲等，與腫瘤的發生發展有著密切關系[11]。本研究通過雙熒光素酶報告基因活性檢測來驗證TGFβR3基因是否為miR-let-7a的靶向調控基因，為進一步研究miR-let-7a的抑癌作用提供分子機制基礎。

1 材料和方法

1.1 材料 人腎胚293T（HEK293T）細胞購于中國科學院上海細胞所。pGEM-T載體、雙熒光素酶報告載體（pmirGLO載體）均購自美國Promega公司。限制性內切酶PmeI和SalI、DNA連接酶購自美國NEB公司，PCR試劑盒、大腸桿菌菌株DH5α、質粒提取及膠回收試劑盒均購自北京天根生化科技有限公司，DL10003購自上海捷瑞生物工程有限公司，脂質體轉染劑Lipofectamine 2000、SYBR Green PCR Master Mix、胰蛋白酶、DMEM、Trizol、Opti-MEM medium等購自美國Invitrogen公司，miR-let-7a mimics和陰性對照（miR-let-7a NC）購自廣州銳博生物技術有限公司。所有引物均由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 引物設計：通過microRNA靶基因在線預測軟件targetscan獲取miR-let-7a與TGFβR3基因3’UTR潛在的互補結合位點，再從GeneBank數據庫中獲得TGFβR3基因3’UTR序列（基因號NM_003243.4），利用Primer Premier 5引物設計軟件設計擴增包含TGFβR3基因3’UTR上miR-let-7a預測結合位點的正向引物和反向引物，并在正向引物5’端加上限制性內切酶PmeI及其保護堿基，反向引物加上限制性內切酶SalI及其保護堿基。根據定點突變試劑盒說明書設計用于miR-let-7a潛在結合位點定點突變的突變引物。具體引物序列見表1，其中下劃線分別表示PmeI、SalI酶切位點，AGCTTT、GC代表保護堿基。

表1 引物序列

1.2.2 TGFβR3基因3’UTR序列的擴增：嚴格按照基因組DNA提取試劑盒說明書抽提人基因組DNA，再以人基因組DNA為模板，應用PCR反應擴增人TGFβR3基因3’UTR序列。PCR反應步驟：94 ℃預變性3 min，94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s循環30次后，72 ℃延伸5 min。擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳后進行切膠回收純化。

1.2.3 pGEM-T載體的構建：將pGEM-T載體和切膠回收純化的PCR產物在T4 DNA連接酶的作用下進行連接反應，4 ℃連接過夜，經轉化擴增后構建易于突變反應的野生型pGEMT-TGFβR3 3’UTR載體（命名為pGEMT-TGFβR3 3’UTR-WT）。然后用點突變引物按定點突變試劑盒說明書進行點突變PCR反應構建出突變型pGEMT-TGFβR3 3’UTR載體（命名為pGEMTTGFβR3 3’UTR-MUT）。

1.2.4 雙熒光素酶報告載體的構建和鑒定：將pGEMT-TGFβR3 3’UTR-WT或pGEMT-TGFβR3 3’UTR-MUT載體和pmirGLO載體分別用限制性內切酶PmeI和SalI在37 ℃水浴鍋中進行雙酶切過夜。將酶切產物用瓊脂糖凝膠電泳后進行切膠回收純化，將純化的pmirGLO載體和TGFβR3 3’UTR-WT/MUT片段分別在T4 DNA連接酶的作用下進行連接反應，4 ℃連接過夜。再經轉化擴增得到野生型和突變型重組pmir-GLO載體，分別命名為pmirGLO-TGFβR3 3’UTR-WT和pmirGLO-TGFβR3 3’UTR-MUT。取1 μL擴增后的菌液進行PCR擴增，其產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，篩選出陽性克隆重組質粒，最后送南京金斯瑞生物科技有限公司測序。

1.2.5 重組質粒轉染HEK293T細胞：將HEK293T細胞接種于24孔板，在37 ℃恒溫、5% CO2的飽和濕度培養箱中培養過夜，待細胞融合度達到70%時，用Lipofectamine 2000轉染試劑將miR-let-7a mimics或miR-let-7a NC分別與重組pmirGLO載體（pmirGLOTGFβR3 3’UTR-WT或pmirGLO-TGFβR3 3’UTR-MUT）共轉染HEK293T細胞，分別記為miR-let-7a mimics組和miR-let-7a NC組，轉染48 h后裂解細胞，檢測熒光素酶活性。

1.2.6 雙熒光素酶活性測定：將共轉染48 h的細胞去除培養基，用PBS緩沖液洗滌細胞3次。每孔加入100 μL的1×PLB到24孔培養板中，室溫輕緩晃動培養板15 min，將裂解液轉移到EP管中。從EP管中轉移20 μL裂解液到檢測管中，再加入100 μL LAR II，混合后檢測螢火蟲熒光素酶的活性；接著向檢測管中加入100 μL Stop&Glo試劑，檢測海腎熒光素酶活性，結果以螢火蟲熒光素酶活性與海腎熒光素酶活性的比值表示。

1.3 統計學處理方法 采用SPSS20.0統計軟件進行分析。計量資料以表示，2組間比較采用獨立樣本t檢驗，方差不齊時采用近似t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 TGFβR3與let-7a靶向關系預測 采用生物信息分析工具targetscan等預測后，發現TGFβR3基因的3’UTR第2 994～第3 001位堿基存在miR-let-7a的潛在結合位點（見圖1），并且預測評分百分比高達94%，miR-let-7a具有很大的概率靶向調控TGFβR3基因。因此，選取TGFβR3作為本研究的目的基因。

圖1 TGFβR3 3’UTR上miR-let-7a的潛在結合位點

2.2 pGEM-T載體的構建 通過PCR反應擴增目的基因TGFβR3 3’UTR片段，片段大小1 229 bp（見圖2A），將目的片段插入易于突變實驗的pGEM-T載體（pGEMT-TGFβR3 3’UTR-WT），將pGEMT-TGFβR3 3’UTRWT進行定點突變獲得突變型pGEM-T載體（pGEMTTGFβR3 3’UTR-MUT）。對陽性單克隆菌落進行菌落PCR反應鑒定，PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳分析后可見明亮的單一條帶，插入TGFβR3 3’UTR片段大小與預期長度一致（見圖2B）。

2.3 雙熒光素酶報告載體的構建和鑒定 將易于點突變反應的載體pGEMT-TGFβR3 3’UTR-WT和pGEMTTGFβR3 3’UTR-MUT分別進行雙酶切反應獲取目的片段，片段大小1 229 bp（見圖3A），膠回收后插入雙熒光素酶報告載體。對重組雙熒光素酶報告載體（pmirGLO-TGFβR3 3’UTR-WT和pmirGLO-TGFβR3 3’UTR-MUT）進行測序鑒定，經測序結果比對，重組載體pmirGLO-TGFβR3 3’UTR-WT中miR-let-7a的潛在結合位點上下游序列與GeneBank數據庫序列完全一致，并且重組載體pmirGLO-TGFβR3 3’UTR-MUT中的miR-let-7a潛在結合位點CTACCTCA成功突變為CTGC GGCA（見圖3B），成功構建野生型和突變型TGFβR3 3’UTR雙熒光素酶報告載體。

圖2 瓊脂糖凝膠電泳鑒定目的片段TGFβR3 3’UTR

圖3 雙熒光素酶報告載體的構建和鑒定

2.4 轉染重組質粒的細胞熒光素酶活性的表達 通過雙熒光素酶報告系統檢測顯示，相比于miR-let-7a NC組，miR-let-7a mimics和野生型重組載體pmirGLO-TGFβR3 3’UTR-WT共轉染后的螢火蟲熒光素酶與海腎熒光素酶活性的比值出現較明顯的下降；而在TGFβR3 3’UTR的潛在結合位點發生點突變之后，共轉染突變型重組載體pmirGLO-TGFβR3 3’UTRMUT后，miR-let-7a mimics組和miR-let-7a NC組的螢火蟲熒光素酶活性與海腎熒光素酶活性的比值差異卻沒有統計學意義（見表2）。這說明TGFβR3 3’UTR存在miR-let-7a的結合位點，并且miR-let-7a特異性作用于這一結合位點，抑制TGFβR3基因的表達。

表2 轉染后2組細胞螢火蟲熒光素酶活性與海腎熒光素酶活性的比值（n=3）

表2 轉染后2組細胞螢火蟲熒光素酶活性與海腎熒光素酶活性的比值（n=3）

pmirGLO-TGFβR3 3’UTR-MUT miR-let-7a NC組 1.00±0.02 1.00±0.07 miR-let-7a mimics組 0.67±0.05 1.01±0.06 t 11.390 0.428 P 0.008 0.691組別 pmirGLO-TGFβR3 3’UTR-WT

3 討論

miR-let-7a是最早發現，也是目前研究最廣泛的microRNA之一[12]。過去大量研究表明，miR-let-7a在腫瘤細胞中的表達量通常是下調的，提示miR-let-7a的功能抑制與腫瘤的發生發展密切相關[13-14]。microRNA的作用機理是通過與靶基因mRNA的3’UTR特異性結合，從而降解靶基因mRNA或者抑制靶基因mRNA的翻譯過程[1]。3’UTR是mRNA的3’端非編碼區，存在不同microRNA的特定結合位點，并且對mRNA的翻譯以及穩定性具有重要作用[15]。因而，尋找miR-let-7a直接靶向調控的靶基因是研究其對腫瘤的作用機制的關鍵之一。在143例肺癌標本分析中發現miR-let-7a家族的表達量出現下調，通過過表達miR-let-7a抑制了細胞增殖能力[9]，并且RAS和HMGA2是miR-let-7a直接靶向調控的靶基因[16-17]。另外，miR-let-7a通過靶向調控HMGA2抑制黑色素瘤細胞的遷移能力[2]、膠質瘤細胞的增殖與侵襲能力[18]。在前列腺癌中，miR-let-7a通過靶向下調IGF1R抑制腫瘤細胞增殖并且促進腫瘤細胞凋亡[19]。在45例生殖細胞腫瘤芯片中，MURRAY等[20]發現17例睪丸惡性生殖細胞腫瘤中miR-let-7家族（含miR-let-7a）的表達均出現顯著下降，并且后續在睪丸胚胎癌細胞實驗中通過上調miR-let-7e的表達量，能夠降低促癌蛋白AURKB、LIN28、MYCN等的水平。這些研究都表明miR-let-7a通過直接靶向調控靶基因在抑制腫瘤發展進程中發揮重要作用。

通過生物信息學分析，miR-let-7a還存在大量未發現的靶基因。在本研究中，我們利用microRNA靶基因預測軟件targetscan分析發現，miR-let-7a可以特異性結合TGFβR3基因的3’UTR，其結合位點在3’UTR的第2 994～第3 001位堿基CUACCUCA。而TGFβR3是細胞內含量最豐富的一種蛋白多糖，是TGFβ的受體之一[21]。TGFβR3通過結合TGFβR1和TGFβR2使其同型受體更易與配體相結合，從而協同激活下游SMAD信號通路[22-23]。有研究表明，TGFβR3的表達及TGFβ/SMAD信號通路與癌癥的關系非常密切，并在多種不同的腫瘤模型中均有調控細胞轉移、侵襲、增殖以及血管生成的作用，可調控多種腫瘤的進程[24-25]。并且在體外乳腺癌細胞和體內裸鼠乳腺癌移植模型中，TGFβR3均可以抑制腫瘤血管生成，并且能夠有效抑制腫瘤的生長[26-27]。我們通過構建TGFβR3 3’UTR重組雙熒光素酶報告載體，并利用雙熒光素酶報告實驗證實了miR-let-7a與TGFβR3基因之間具有靶向調控關系，且證實miR-let-7a特異性作用于TGFβR3基因的3’UTR位置的第2 994～第3 001序列堿基，對TGFβR3基因表達進行負調控。因而我們推測miR-let-7a可能通過靶向調控TGFβR3基因，并且可能通過TGFβ/SMAD信號通路傳導信息，從而達到腫瘤抑制作用。這一研究結果有利于我們進一步研究腫瘤的調控機制，為研究miR-let-7a抑制腫瘤的分子機制提供基礎，并且在應用miR-let-7a對腫瘤進行分子治療時提供有效幫助。

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（本文編輯：賈建敏）

Construction of TGFβR3 gene 3’UTR dual luciferase reporter vector and targeting veri fi cation between

TGFβR3 and miR-let-7a ZHOU Huandong, GU Rui, WU Dazhou, CHEN Xiaoming. Department of Pediatric Surgery, the First Af fi liated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325015

Objective: To construct a luciferase reporter vector containing the 3’untranslated region (3’UTR) of TGFβR3 gene and evaluate the targeting correlation between TGFβR3 and miR-let-7a. Methods: The potential complementary binding sites of miR-let-7a and TGFβR3 were predicted by targetscan. The 3’UTR fragment of TGFβR3 ampli fi ed by PCR was fi rstly cloned into pGEM-T vector and the potential complementary binding sites was mutated. Then, the ampli fi ed fragment and the mutated fragment of TGFβR3 3’UTR were subcloned into pmirGLO dual-luciferase miRNA target expression vector within the PmeI/SalI restriction sites. The luciferase reporter vector and miR-let-7a mimics/miR-let-7a NC were co-transfected into HEK293T cells respectively. The relative luciferase activity was detected by luciferase reporter assay. Results: Results of double enzyme digestion and DNA sequencing con fi rmed that the luciferase reporter vector was successfully constructed. The relative luciferase activity of TGFβR3 3’UTR reporter vector and miR-let-7a mimics co-transfected group were decreased signi fi cantly comparing with miR-let-7a NC group (P＜0.05), but the relative luciferase activity was no signi fi cance in TGFβR3 3’UTR mutated reporter vector. Conclusion: The luciferase reporter vector containing the 3’UTR-WT or 3’UTR-MUT of TGFβR3 is constructed successfully. And TGFβR3 is a direct novel target gene of miR-let-7a.

microRNAs; miR-let-7a; transforming growth factor beta receptor 3; luciferase reporter vector

R73

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2017.05.001

2016-11-21

國家自然科學基金資助項目（81673643）；浙江省科技廳公益性技術應用研究項目（2012C23066）。

周歡棟（1990-），男，浙江諸暨人，碩士生。

陳肖鳴，主任醫師，教授，碩士生導師，Email：cxm@ wmu.edu.cn。