前列腺增生后不穩(wěn)定膀胱致逼尿肌肌聚糖表達變化

木海琦，朱詩建，王帥彬，南存金，包云帆，陳映鶴

（1.溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院 泌尿外科，浙江 溫州 325027；2.溫州醫(yī)科大學附屬蒼南醫(yī)院 泌尿外科，浙江 溫州 325800）

?臨 床 經(jīng) 驗?

前列腺增生后不穩(wěn)定膀胱致逼尿肌肌聚糖表達變化

木海琦1，朱詩建2，王帥彬1，南存金1，包云帆1，陳映鶴1

（1.溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院 泌尿外科，浙江 溫州 325027；2.溫州醫(yī)科大學附屬蒼南醫(yī)院 泌尿外科，浙江 溫州 325800）

目的：探討良性前列腺增生（BPH）后不穩(wěn)定膀胱導致膀胱逼尿肌肌聚糖（SG）表達變化。方法：對BPH后穩(wěn)定膀胱組患者34例、BPH后不穩(wěn)定膀胱組患者26例，采用免疫組織化學染色法、Western blot法檢測膀胱壁逼尿肌中SG的α、β、γ 3種亞基蛋白表達情況，RT-PCR法檢測SG的α、β、γ 3種亞基mRNA表達水平。結果：SG在BPH后不穩(wěn)定膀胱組的平均表達水平較穩(wěn)定膀胱組增加，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05)。結論：BPH后膀胱逼尿肌不穩(wěn)定性可能與SG改變有關。

良性前列腺增生；不穩(wěn)定膀胱；肌聚糖

前列腺增生（benign prostatic hyperplasia，BPH）后膀胱也發(fā)生相應改變，出現(xiàn)逼尿肌結構、功能及神經(jīng)支配的變化，引起膀胱不穩(wěn)定收縮，表現(xiàn)為尿頻、尿急、急迫性尿失禁等一系列癥狀[1]。肌聚糖（sarcoglycan，SG）是肌肉收縮相關的功能蛋白，既往研究[2-4]發(fā)現(xiàn)其與心肌、骨骼肌、血管平滑肌等功能變化相關。本課題組前期研究[5]發(fā)現(xiàn)當膀胱逼尿肌收縮力下降時，逼尿肌內SG表達將出現(xiàn)顯著下降。本研究通過檢測膀胱逼尿肌SG表達，探討其在BPH所致不穩(wěn)定膀胱逼尿肌中發(fā)生的變化。

1 對象和方法

1.1 對象 收集2014年6月至2015年4月因BPH住院手術的患者。根據(jù)尿動力檢查中膀胱充盈時是否出現(xiàn)膀胱壓力≥1.47 kPa，且不能被主動抑制的逼尿肌不自主收縮，將患者分為穩(wěn)定膀胱組（穩(wěn)定組）34例，年齡59～88歲，平均（71.23±5.24）歲；不穩(wěn)定膀胱組（不穩(wěn)定組）26例，年齡61～90歲，平均（73.17±6.31）歲。2組年齡無明顯差異且均無影響膀胱功能的疾病。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審查，所有受試者均簽署知情同意書。

1.2 主要試劑 兔抗人α-SG單克隆抗體、鼠抗人β-SG單克隆抗體、兔抗人γ-SG多克隆抗體購自美國Abcam公司；TrizolTM試劑盒購自美國Gibco公司；SYBR Green熒光染料購自美國Roche公司；Prime-Script RT reagent Kit購自日本Takara公司。

1.3 方法

1.3.1 標本的收集與處理：2組患者均采取恥骨上前列腺摘除術，術中取膀胱前壁全層。剔除黏膜及其他組織后一份置入液氮保存，一份常規(guī)脫水透明后，石蠟包埋切片。

1.3.2 免疫組織化學SP法檢測SG 3種亞型（α、β、γ）表達：按照試劑盒說明書操作，切片常規(guī)脫蠟，枸櫞酸鹽修復，經(jīng)3% H2O2阻斷過氧化物酶活性及山羊血清封閉后，滴加按比例稀釋后的一抗，4 ℃過夜，DAB顯色，蘇木素復染，中性樹膠封片，鏡檢觀察。在光學顯微鏡下每張切片隨機選取10個視野采集圖像，應用Image Pro Plus軟件分析陽性區(qū)域，計算積分密度值（IOD）來反映陽性蛋白的強度或濃度。

1.3.3 Western blot法檢測SG 3種亞型表達：用含PMSF的蛋白裂解液提取組織中蛋白，BCA法測定蛋白濃度。取50 μg蛋白煮沸變性后，進行SDS-PAGE凝膠電泳、轉膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h。加入一抗，4 ℃冰箱搖床過夜，加入相應二抗，ECL化學發(fā)光、顯影、定影。Bio-Rad Quantity軟件分析測定其區(qū)帶的吸光度，GAPDH為內參，目的片段與GAPDH的吸光度比值表示蛋白表達水平。

1.3.4 RT-PCR法檢測SG 3種亞型mRNA表達：組織塊解凍后置于1 mL Trizol抽提試劑中充分裂解，在抽提時加入200 μL氯仿，并采用預冷處理后75%乙醇洗滌RNA沉淀，溶于DEPC水中，保存于-80 ℃?zhèn)溆谩８鶕?jù)反轉錄試劑盒說明書進行RNA反轉錄。反轉錄反應條件：25 ℃ 10 min；42 ℃ 60 min；52 ℃15 min；70 ℃ 15 min；終止反應，所得cDNA溶液置冰中5 min后-20 ℃保存。由上海基康公司設計合成引物，使用SYBR GreenI RT PCR反應體系擴增。PCR反應條件為：95 ℃預變性5 min后，95 ℃ 10 s；60 ℃ 10 s；72 ℃ 10 s，40個循環(huán)。

1.4 統(tǒng)計學處理方法 應用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計處理。數(shù)據(jù)采用表示，2組間比較采用秩和檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 SG 3種亞型免疫組織化學染色結果 SG蛋白免疫陽性產(chǎn)物呈棕黃色顆粒，主要位于細胞漿，光鏡下可見與膀胱逼尿肌細胞走向一致。與穩(wěn)定組相比，不穩(wěn)定組中棕黃色陽性染色比例均升高，表明該組膀胱壁中的SG 3種亞型（α、β、γ）蛋白表達量升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖1和表1。2.2 SG 3種亞型Western blot檢測結果 經(jīng)Western blot半定量檢測SG表達量，與穩(wěn)定組相比，不穩(wěn)定組中SG 3種亞型（α、β、γ）表達量均升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖2。

圖1 SG 3種亞型（α、β、γ）在膀胱組織中的表達情況（×400）

表1 SG蛋白在不同組中的IOD（）

表1 SG蛋白在不同組中的IOD（）

與穩(wěn)定組比：aP＜0.05

組別 例數(shù) α-SG β-SG γ-SG穩(wěn)定組 34 192.37±34.92 261.48±48.78 104.05±30.66不穩(wěn)定組 26 525.16±58.37a593.28±49.98a442.31±39.82a

圖2 SG 3種亞型表達情況

2.3 SG 3種亞型mRNA表達情況 經(jīng)RT-PCR儀擴增，不穩(wěn)定組SG 3種亞型的mRNA相對表達量分別為2.32±0.45、2.02±0.39、2.57±0.74；穩(wěn)定組分別為0.79±0.26、0.52±0.12、1.21±0.53，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

3 討論

BPH是引起中老年男性排尿功能障礙最為常見的良性疾病之一，其中不穩(wěn)定膀胱是其重要的病理生理改變[1]。1987年國際尿控學會（International Continence Society，ICS）將不穩(wěn)定膀胱定義為在膀胱充盈時出現(xiàn)自發(fā)或被誘發(fā)的膀胱壓力大于或等于1.47 kPa且不能被主動抑制的膀胱逼尿肌不自主收縮[6]。有52%～80% BPH患者出現(xiàn)不穩(wěn)定膀胱表現(xiàn)。但目前對不穩(wěn)定膀胱的病因機制尚無定論，治療效果并不理想。膀胱是一種順應性良好的空腔器官，在充盈和排空時膀胱壁能夠自我調節(jié)伸展、重構以適應膀胱容量的改變，而不引起明顯的膀胱內壓改變。當BPH后引起膀胱不穩(wěn)定收縮時，膀胱的一系列生物力學特征就發(fā)生了改變，這一過程包括了很多中間環(huán)節(jié)，如膽堿能神經(jīng)超敏化、腎上腺受體改變等，其中逼尿肌本身是一重要的改變因素[7]。

在骨骼肌及心肌的肌膜上存在著抗肌萎縮相關蛋白復合體，稱為DGC復合體，該復合體為一種跨膜復合體，能將單個肌細胞通過“肌絲相互滑動”產(chǎn)生的力傳遞到細胞外基質，整合后形成肌肉收縮[8-9]。而SG是DGC復合體的主要成分之一，是一種黏附分子，能維持肌膜組織結構的穩(wěn)定性及Ca2+平衡[10]。ANASTASI等[11]在胃腸道等組織器官中發(fā)現(xiàn)了SG，泌尿系器官均屬于平滑肌器官，理論上也應該存在該蛋白。ARENA等[12]研究發(fā)現(xiàn)原發(fā)性膀胱輸尿管反流可能與SG過表達后平滑肌功能亢進相關，但具體機制尚待明確。我們前期通過建立雄兔膀胱出口梗阻模型，當梗阻達到一定時間后，逼尿肌中β、γ-SG蛋白表達下降[13]，而人BPH后造成膀胱收縮力的下降同樣與該蛋白表達下調有關[5]。

本研究發(fā)現(xiàn)SG上調可能與逼尿肌不穩(wěn)定相關。膀胱逼尿肌組織與胃腸道等平滑肌一樣，其收縮主要依賴于細胞漿中Ca2+與粗肌絲中肌球蛋白結合而觸發(fā)[14]，而SG具有維持Ca2+平衡的作用。因此我們推測這種改變容易導致不穩(wěn)定膀胱的發(fā)生，其可能的機制是：隨著SG表達上調，膜外的Ca2+進入細胞內增多，引起細胞內肌漿網(wǎng)中Ca2+進一步釋放，從而導致膀胱逼尿肌細胞具有更高的興奮性，從而引起不穩(wěn)定收縮，導致患者尿頻、尿急以及急迫性尿失禁等臨床癥狀。但具體通過何種方式相聯(lián)系，尚需更深一步研究加以明確。

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（本文編輯：趙翠翠）

The expression change of sarcoglycan in the detrusor muscle of unstable bladder caused by benign prostatic hyperplasia

MU Haiqi1, ZHU Shijian2, WANG Shuaibin1, NAN Cunjin1, BAO Yunfan1, CHEN Yinghe1.

1.Department of Urology, the Second Af fi liated Hospital & Yuying Children’s Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325027; 2.Department of Urology, Cangnan Hospital Af fi liated to Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325800

Objective: To study the expression change of sarcoglycan (SG) in the detrusor muscle of the unstable bladder caused by benign prostatic hyperplasia (BPH). Methods: 34 cases of stable bladder and 26 cases of unstable bladder were included in this study. The expressions of α-SG, β-SG, γ-SG in detrusor muscle of bladder were detected by immunohistochemical technique Western-blot and RT-PCR. Results: Compared to the group of stable bladder, the expression of SG in detrusor muscle of unstable bladder caused by BPH was increased (P＜0.05). Conclusion: The changes of SG in the detrusor muscle of bladder may closely related to the production of unstable bladder caused by BPH.

benign prostatic hyperplasia; unstable bladde; sarcoglycan

R69

B

10.3969/j.issn.2095-9400.2017.05.011

2016-06-13

溫州市公益性科技計劃項目（Y20150219）。

木海琦（1982-），男，浙江溫州人，主治醫(yī)師，碩士。

陳映鶴，主任醫(yī)師，Email：chenyh@wzhealth.com。