實驗性前導斜度改變的大鼠模型的建立及其顳下頜關節滑膜組織病理學觀察

李雨軒 翟桐 譚文宏 白樂康 肖敏

西安交通大學口腔醫院修復科，西安 710004

實驗性前導斜度改變的大鼠模型的建立及其顳下頜關節滑膜組織病理學觀察

李雨軒 翟桐 譚文宏 白樂康 肖敏

西安交通大學口腔醫院修復科，西安 710004

目的 建立穩定的前導斜度改變的大鼠模型，探索其對大鼠顳下頜關節（TM J）滑膜的組織病理學影響。

方法 將32只大鼠隨機分為4組，分別是對照組（C）、前導缺失組（T1）、前導斜度增大15°組（T2）、前導斜度增大30°組（T3）。在大鼠上前牙粘接舌側增大15°、30°金屬冠改變相應前導斜度。采用低速金剛砂輪打磨大鼠上下前牙，使下頜在各個方向運動時上下牙切緣不接觸，造成前導缺失。3、7、14、28 d各處死2只。實驗結束后取大鼠一側TM J作石蠟切片蘇木精-伊紅（HE）染色，通過組織病理學診斷鑒定大鼠TM J滑膜的改變。結果 T1組體重短暫下降后緩慢增加（P<0.05），T3組體重明顯下降后略回升，但始終低于初始體重（P<0.05），T3組滑膜襯里細胞增生，血管擴張明顯（P<0.05）。結論 本研究所建立的前導斜度增大30°大鼠模型能較好地模擬臨床上前導斜度過大造成的TMJ滑膜出現的組織病理變化過程。提示前導斜度增大越多，發生TMJ滑膜損傷的風險越大。而前導缺失對TMJ滑膜的影響有待進一步確定。

前導斜度； 前導缺失； 顳下頜關節； 滑膜

前導的概念最早由Broderson在1978年提出，是指在下頜各個方向的功能運動中上下頜前牙接觸關系。Donegan等[1]發現前牙修復中存在過度恢復前牙舌側厚度和形態的情況。并提出了過度的恢復上切牙舌側面的外形來增加與下切牙的接觸關系是不正常的，可能是有害的。在臨床中，也觀察到類似的病例，調磨其舌側過厚的外形后，患者出現的顳下頜關節（temporomandibular joint，TM J）不適癥狀有所減輕或消失。

前導對下頜前伸、側方運動具有主要引導作用，下頜運動時前導使后牙脫離咬合接觸，減少后牙干擾引起的下頜異常運動，其是維持口頜系統健康的重要因素，滑膜及滑膜液的改變已經成為臨床上診斷顳下頜關節紊亂病（temporomandibular disorders，TMD）的根據之一，而關于前導與TMJ滑膜的相互關系及影響的研究較少。本研究通過模擬前導斜度增大和缺失的情況，建立大鼠動物模型，以此為基礎探討其對大鼠TM J滑膜的改變作用和程度，為修復和正畸治療提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 實驗動物分組

選取由西安交通大學醫學院動物實驗中心提供的雌性SD大鼠32只，體重220~260 g，隨機分為4組，每組8只，分別為對照組（C）、前導缺失組（T1）、前導斜度增大15°組（T2）、前導斜度增大30°組（T3）。實驗期為28 d。

1.2 前導缺失及前導斜度增大的處理方法

1.2.1 建立前導缺失動物模型 采用低速連柄砂輪同時打磨大鼠上下前牙，消除上下牙在下頜各方向運動時的接觸；每2 d打磨一次，按第一次磨牙后的牙長度數據作參照處理。

1.2.2 建立前導增大動物模型 用硅橡膠制作大鼠前牙局部托盤，待托盤成形后再次用硅橡膠給大鼠前牙取模，灌制超硬石膏模型，在模型上用自凝造牙樹脂制作舌側增大15°、30°冠（此角度為上牙舌面與冠舌面的夾角即為前導斜度增大的角度）。將做好的樹脂牙冠翻制鑄造成金屬冠。在麻醉、隔濕條件下將金屬全冠粘接在SD大鼠上頜雙側前牙上。對照組不做處理，實驗結束之前在同樣情況下飼養。隔日記錄體重數據和金屬冠在口內維持情況（圖1）。

1.3 標本的處理

于實驗后3、7、14、28 d每組各處死2只，10%水合氯醛0.003 m L·g-1腹腔注射，麻醉大鼠，主動脈插管快速推進生理鹽水，繼續灌注4%多聚甲醛，取一側完整TM J關節（另一側關節滑膜取出為下一步實驗所用），置于40 g·L-1多聚甲醛中固定24 h后，EDTA中脫鈣1個月，常規脫水，石蠟包埋，沿矢狀方向連續切片，厚度為5 μm。

圖 1 動物模型示意圖Fig 1 Schematic diagram of animal model

1.4 組織形態學染色及圖像分析

每個標本取正中矢狀面2張切片，共計64張，常規蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色，在Olympus DP71顯微照相系統下采圖，對各樣本于× 40倍鏡下，DP Controller軟件中觀察關節盤后部雙板區被覆的滑膜組織（圖2），評估滑膜組織形態學變化。由兩名觀察者盲法觀察免疫組化染色結果，隨機選擇不重疊的10個視野，人工計數，計算該區域內計數等級，3次計數的均值被用于后續的統計分析。染色結果的評判標準[2]如下。滑膜細胞層數：0級：1~3層；1級：4~6層；2級：≥7層。血管擴張：0級：未出現；1級：累及小于滑膜長度的1/3；2級：累及滑膜長度的1/3~2/3；3級：累及大于滑膜長度的2/3。纖維素沉積：同血管擴張。

1.5 統計學分析

采用統計軟件SPSS 20.0對實驗結果進行分析，體重數據采用4×4析因設計的方差分析。不同時間組間差異采用重復測量的方差分析，差異無統計學意義。故析因設計時選擇處死最終體重作為結局指標。HE染色結果的等級資料采用多樣本的秩和檢驗分析，所有樣本采用雙側檢驗，檢驗水準為0.05，組間比較據比較次數將水準調整為0.05/6=0.008。

圖 2 大鼠TM J矢狀面切片示意圖Fig 2 Schematic diagram of a sagittal section of the rat’s TMJ

2 結果

2.1 體重變化

C組動物隨著鼠齡增加，體重逐漸增加；T1組體重短暫下降后緩慢增加；T2組體重呈緩慢增加；T3組體重下降明顯后略回升。根據析因分析結果，不同實驗組間體重變化有統計學意義（P<0.05）；不同時間組體重變化無統計學差異；而處理分組與時間存在的交互作用具有顯著差異（P<0.05）。兩兩比較顯示：T3組與T2和C組比較差異有統計學意義（P<0.05），T1與C組比較差異有統計學意義（P< 0.05），其他方式處理組間兩兩比較均無統計學意義（P>0.008）（圖3）。

圖 3 析因設計各組大鼠體重結果圖Fig 3 The changes of rat’s weights between the four groups by fac- torial design

2.2 TMJ滑膜組織改變

TMJ滑膜組織改變見圖4、表1。

圖 4 TM J滑膜組織觀察結果 HE × 40Fig 4 Histomorphology changes in the synovial tissue of the TMJ HE × 40

表 1 各組樣本滑膜組織形態學變化結果Tab 1 The morphological changes of synovial tissue in each group

不同組間滑膜細胞增生、血管擴張、纖維素沉積均有統計學差異（P<0.05）。C組TM J關節盤雙板區附近滑膜細胞1~2層，表面光滑，滑膜下層中的血管未見擴張，未出現炎性改變的證據；與C組相比，T3組滑膜襯里細胞增生，1~2級，血管擴張明顯（P<0.008）。兩兩比較結果，與T3組相比，T1組滑膜層數輕度增生（P>0.008），3 d時纖維素沉積（P>0.008），輕度血管擴張（P<0.008）；T2組滑膜不同時期層數為0級（P<0.008），滑膜下層的血管7 d時擴張（P<0.008），幾乎無纖維素沉積（P<0.008）。

3 討論

本實驗選用大鼠作為研究對象是基于Weijs等[3]研究出其咀嚼運動和TMJ結構與人具有一定類似性。解決前導裝置在大鼠前牙固位的最大一個問題就是大鼠切牙不斷伸長，固位裝置會隨著切牙伸長不斷移動，妨礙了持續而精準的實驗干預且影響大鼠的咀嚼進食。針對這個問題，Schour等[4]給一只大鼠的切牙做冠阻止了切牙的萌出。研究發現在大鼠下切牙上放置牙冠后，出現了釉質有機成分的萎縮，釉基質形成終止，牙源性上皮折疊，實驗表明牙冠的形式干擾了切牙的正常磨耗和生長，在動物前牙實驗中具有重要的意義。

因金屬咬合板和樹脂均難以在大鼠切牙舌側長期固位，且這兩種改變前導斜度的裝置會隨著切牙不斷生長而移位，造成干擾。故本研究采用給大鼠上切牙粘接舌側增大15°、30°的金屬冠來構建前導斜度增大的動物模型，這與A rce等[5]的研究結果一致，即牙冠干擾了上切牙的磨耗和生長，在大鼠切牙粘接牙冠后的1個月實驗期內，牙冠保持穩定，上切牙停止生長且長度無明顯變化。

本實驗模擬了臨床上有學者[1,6]提出的上前牙修復體舌側過陡而增加了前導角度的情況和Kerstein等[7]在臨床上注意到前導缺失伴有TMD癥狀的情況，以及Guinn等[6]提出了前導角度尤其重要的情況，這些臨床問題都提示前導改變造成了對TMJ的不良影響。大鼠前牙前導可變空間較大，前導增大30°時上前牙牙冠舌側面緊貼下前牙唇面，下頜前伸的軌跡幾乎是先垂直向下到切緣再向前運動，伴有輕微的下頜后退。故本實驗將大鼠增加的前導角度最大值定為30°。并設立前導增大15°組，以達到梯度對比的目的，所有動物在相同條件下飼養排除了其他因素的干擾。

前導增大30°時大鼠體重先明顯降低，后緩慢升高（P<0.05）；前導缺失時大鼠體重短暫下降后緩慢增加（P<0.05），因進食量與體重直接相關，此兩種改變造成了大鼠進食困難，隨后推測咀嚼肌及TM J形成了某種補償，進食量逐步增加，體重有所回升。

TMJ滑膜內襯細胞通常為1~4層，在正常情況下細胞分裂速度極低，但在急性創傷或不良刺激作用下，滑膜細胞迅速增殖[8]。滑膜下血管神經豐富，因此非常容易出血。在前導斜度增大30°組，血管擴張3 d時出現（P<0.05），滑膜細胞增生明顯，伴有一定程度的纖維素沉積，且隨時間并未減輕。說明此時TM J受到了一定的創傷和刺激，其發生的可能機制是前導斜度增大到30°，引起了髁突后退，對雙板區滑膜皺襞的壓力增大，這與陳彩云[9]建立的咬合創傷模型對大鼠TM J滑膜影響的研究結果有一定相似性。

在前導斜度增大15°組，未見明顯的炎癥改變，僅在3、7 d觀察到滑膜下血管的輕度擴張。說明前導斜度增大15°的改變還不足以引起TMJ滑膜的改變。或者在建模最初即引起了滑膜改變，但在第3天改變已被代償。

在前導缺失組，3 d時滑膜細胞出現輕度增生和輕度血管擴張、纖維素滲出，而隨后的時間點滑膜均未見明顯炎癥改變，這與孫蓮等[10]建立的大鼠前牙開 ，喪失前導而引發的TM J骨關節炎樣退變的結果并不一致，其原因可能是本實驗前導缺失模型并未使用對大鼠持續張口的方法，關節腔壓力并無明顯變化，主要是以血管擴張及毛細血管通透性升高，血管中的纖維蛋白滲出到血管外為主要反應的變化。

綜上所述，前導增大30°可導致TMJ滑膜出現炎癥性改變，前導斜度增大30°可能是不影響大鼠生存前導增大的極限角度，這提示臨床前導斜度越陡，發生TM J滑膜炎癥的風險越大。而前導缺失引起了大鼠TM J滑膜的急性炎癥，可在短期內很快消失，由此推測大鼠前導缺失不足以引起嚴重而持續的滑膜炎癥。

[1] Donegan SJ, Knap FJ. A study of anterior guidance[J]. J Prosthodont, 1995, 4(4):226-232.

[2] Muto T, Kawakam i J, Kanazawa M, et al. Development and histologic characteristics of synovitis induced by trauma in the rat temporomandibular joint[J]. Int J Oral Maxillofac Surg, 1998, 27(6):470-475.

[3] Weijs WA, Dantuma R. Electromyography and mechanics of mastication in the albino rat[J]. J Morphol, 1975, 146(1): 1-33.

[4] Schour I, Massler M. The teeth[M]. Philadelphia: JB Lippincott Company, 1949:104-160.

[5] Arce C, Erausquin J. Supresión experimental de la erupción en los incisivos de la rata[M]. Rev Odontol: Buenos Aires, 1944.

[6] Guinn JL, W illiams BT. Choosing the right appliance[J]. J Craniomandib Pract, 1985, 3(3):289-293.

[7] Kerstein RB, Farrell S. Treatment of myofascial pain-dysfunction syndrome with occlusal equilibration[J]. J Prosthet Dent, 1990, 63(6):695-700.

[8] de Bont LG, Liem RS, Boering G. Ultrastructure of the articular cartilage of the mandibular condyle: aging and degeneration[J]. Oral Surg Oral Med Oral Pathol, 1985, 60(6): 631-641.

[9] 陳彩云. 咀嚼力降低狀態下升高咬合對青春期大鼠顳下頜關節滑膜的影響[D]. 西安: 第四軍醫大學, 2009.

Chen CY. Weaker masticatory muscles affects temporomandibular joint synovitis induced by increase of occlusal vertical dimension in adolescent rats[D]. Xi’an: The Fourth M ilitary Medical University, 2009.

[10] 孫蓮, 張衛兵, 王林. 開 誘導大鼠顳下頜關節骨關節炎樣退變的實驗性研究[J]. 口腔醫學, 2016, 36(5):390-393.

Sun L, Zhang WB, Wang L. Experimental study of inducing an osteoarthritis-like lesion in the rat temporamandibular joint by mouth-opening[J]. Stomatology, 2016, 36(5):390-393.

（本文編輯 杜冰）

Establishment of rat models with altered anterior guidance and observation of histological changes in tem poromandibular joint synovium

Li Yuxuan, Zhai Tong, Tan Wenhong, Bai Lekang, Xiao Min. (Dept. of Prothodontics, Stomatology

Hospital of Xi’an Jiao Tong University, Xi’an 710004, China)

Supported by: Key Science and Technology Foundation of Shanxi Province (2012k16-10-03). Correspondence: Xiao Min, E-mail: 1968143838@qq.com.

ObjectiveThis study aims to establish a stable animal model with altered anterior guidance and investigate histological changes on temporomandibular joint (TMJ) synovium in rats. Methods Thirty-two rats were divided into four groups, namely, control group, anterior-guidance-deficient group (T1), and anterior guidance inclined up to 15 degree (T2) and 30 degree (T3) groups. Metal crowns that add 15 and 30 degrees to the palatal side were cemented to the incisors of maxilla to increase the inclination of anterior guidance. The low-speed diamond wheel shorts for both upper and lower incisors of rats were applied to avoid contact between anterior teeth in all direction, thus establishing an anterior guidance deletion model. TMJ joints on one side of two animals in each group were harvested after 3, 7, 14, and 28 days. Pathological changes were investigated in the TMJ synovium using hematoxylin-eosin (HE) staining.ResultsThe weight of T1 decreased briefly at first, and then increased slightly (P<0.05). The weight of T3 obviously reduced and then slow ly increased, but remained below the initial weight (P<0.05). T3 manifested obvious synovial lining proliferation and vascular dilation (P<0.05).ConclusionThe rat model of anterior guidance inclined up to 30 degree could im itate the pathological features of TMJ synovium with excessive increase in anterior guidance. A higher inclination of anterior guidance m ight cause more damage of TMJ synovium. The effect of anterior guidance deletion on TMJ synovium is yet to be determined.

inclination of anterior guidance; anterior guidance deficiency; temporomandibular joint; synovial membrane

R 782.6

A

10.7518/hxkq.2017.03.005

2016-06-03；

2017-03-10

陜西省社會發展科技攻關基金（2012k16-10-03）

李雨軒，主治醫師，碩士，E-mail：1206502414@qq.com

肖敏，副主任醫師，碩士，E-mail：1968143838@qq.com