復發性阿弗他潰瘍患者可溶性程序性死亡受體1及可溶性程序性死亡配體1表達與免疫功能的相關性

江南 羅亮 劉莉 孫小琴 姜星 蔡揚

貴州醫科大學附屬口腔醫院牙周黏膜科，貴陽 550004

復發性阿弗他潰瘍患者可溶性程序性死亡受體1及可溶性程序性死亡配體1表達與免疫功能的相關性

江南 羅亮 劉莉 孫小琴 姜星 蔡揚

貴州醫科大學附屬口腔醫院牙周黏膜科，貴陽 550004

目的 了解復發性阿弗他潰瘍（RAU）患者血清中可溶性程序性死亡受體-1（sPD-1）、可溶性程序性死亡配體-1（sPD-L1）蛋白表達與患者免疫功能狀態的相關性，探討sPD-1/sPD-L1在RAU免疫發病機制中的作用及意義。方法 研究對象為30例RAU患者（輕型18例，重型5例，皰疹型7例）及18例健康人（對照組）。采用流式細胞術檢測RAU患者外周血細胞免疫指標（CD3+、CD4+、CD8+、CD19+、CD16++56+），散射比濁法檢測RAU患者體液免疫指標（IgG、IgA、IgM、C3、C4），酶聯免疫吸附測定RAU患者及健康人血清中sPD-1、sPD-L1蛋白表達，并對sPD-1、sPD-L1表達水平與RAU患者免疫功能狀況及臨床特征的相關性進行分析。結果 與正常值相比，RAU患者CD4+水平降低，IgM水平增高，差異有統計學意義（P<0.05）。RAU患者的sPD-1及sPD-L1蛋白表達水平高于對照組（P<0.05）；進一步分析表明，輕型、重型RAU患者的sPD-1及sPD-L1蛋白表達水平高于對照組（P<0.05），而皰疹型RAU患者與對照組無統計學差異（P>0.05）。RAU患者sPD-1表達量與CD19+、C4存在正相關關系（r1= 0.389，P1=0.034；r2=0.382，P2=0.037）。結論 RAU患者以細胞免疫功能低下為主，同時伴有體液免疫功能的紊亂；RAU患者sPD-1、sPD-L1蛋白高表達在一定程度上通過影響PD-1/PD-L1信號通路參與RAU免疫機制的調節，可能在RAU的免疫發病機制中起著一定作用。

復發性阿弗他潰瘍； 可溶性程序性死亡受體1； 可溶性程序性死亡配體1； 免疫

復發性阿弗他潰瘍（recurrent aphthous ulcer，RAU）是最常見的口腔黏膜疾病，臨床表現為口腔黏膜上周期性復發性的潰瘍性損害。RAU的發病與遺傳、免疫、環境、感染等多種因素有關，其中免疫因素被認為與該病的發生尤為密切[1]，但具體發病機制目前仍不清楚。程序性死亡受體1（programmed death-1，PD-1）為免疫抑制分子，屬于CD28家族成員的Ⅰ型跨膜蛋白，主要表達于外周CD4+、CD8+T細胞、自然殺傷細胞（natural killer cell，NK）、巨噬細胞、B細胞及其樹突狀細胞表面，PD-1在無功能的T細胞上也呈高表達[2]。PD-1可抑制B細胞受體的刺激性信號，從而降低B細胞活化[3]。程序性死亡配體1（programmed death ligand 1，PD-L1）是PD-1的配體，屬于B7超家族成員，廣泛表達于活化的T細胞、B細胞，以及樹突狀細胞、巨噬細胞、間充質干細胞和培養的骨髓來源的肥大細胞[4]。PD-L1的生物學作用為通過與PD-1分子結合，并活化其胞內段ITIM基序，傳遞正向信號，負性調節T細胞的活化和功能。PD-1/PD-L1是目前免疫學分子領域研究的熱點，其可以協助激活T細胞，又可以通過負性協同刺激信號下調免疫反應。近期研究表明，PD-1、PD-L1除了膜結合型外，還存在可溶性形式，即：可溶性PD-1（soluble programmed death-1，sPD-1）和可溶性PD-L1（soluble programmed death ligand 1，sPD-L1）。研究發現，sPD-1能高親和力結合PD-L1，阻斷PD-L1/PD-1的相互作用，從而增強T細胞的免疫效應[5]；sPD-L1則可與T細胞表面PD-1受體相結合負性調控T淋巴細胞免疫應答，抑制T細胞增殖[6]。它們在多種免疫性疾病發生、發展中發揮重要的調節作用。目前已有新藥CT-011和MDX-1106通過阻斷PD-1而實現了對PD-L1/PD-1相互作用的抑制，從而增強T細胞的免疫效應來達到抗腫瘤的效果[7]。

本研究通過了解RAU患者血清中sPD-1、sPD-L1蛋白表達情況，并分析其與RAU患者免疫功能狀態的相關性，探討sPD-1/sPD-L1在RAU免疫發病機制中的作用及意義。

1 材料和方法

1.1 研究對象

病例選自2012年9月—2013年9月間就診于貴州醫科大學附屬醫院口腔內科黏膜病專科門診初診為RAU的患者30例（RAU組）。其中，男性14例，女性16例；年齡16~72歲，平均年齡（44.03±1.58）歲。按RAU的臨床分型標準[1]，其中輕型18例，重型5例，皰疹型7例。納入標準：1）符合RAU臨床診斷（參考衛生部規劃教材《口腔黏膜病學》 第 4 版）；2）潰瘍頻繁發作病史半年以上（潰瘍復發頻率每月至少 1 次）；3）本次潰瘍發作不超過 72 h，并未進行過局部及全身治療。排除標準：1）患者1 個月內使用過抗生素，3個月內使用過免疫制劑；2）伴有全身系統性疾病（糖尿病、心血管疾病、肝炎、精神病等）或免疫性疾病者；3）有牙齦炎、牙周炎或其他口腔黏膜疾病者；4）月經期、妊娠期婦女。

對照組18例，均為來自于貴州醫科大學附屬醫院體檢中心的年齡、性別與RAU組匹配的健康人。

所有的研究對象均被告知研究內容并簽署知情同意書。

1.2 主要設備及試劑

流式細胞儀、6色TBNK檢測試劑盒（BD公司，美國），特定蛋白分析系統（Beckman Coulter公司，美國），酶標儀（BIO-RAD公司，美國 ），免疫球蛋白G/A/M檢測試劑盒、補體C3/C4 檢測試劑盒（貝克曼庫爾特實驗系統蘇州有限公司），人sPD-1、sPD-L1酶聯免疫吸附測定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒（上海創祥生物科技有限公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 免疫檢測 采集RAU組患者空腹狀態下清晨9點前外周靜脈血兩管，一管抗凝血（3 m L）送至貴州醫科大學附屬醫院中心實驗室，采用流式細胞術檢測患者外周血細胞免疫指標（CD3+、CD4+、CD8+、CD19+、CD16++56+）；另一管非抗凝血（5 m L）送至貴州醫科大學附屬醫院微生物免疫實驗室，采用散射比濁法檢測患者體液免疫指標（IgG、IgA、IgM、C3、C4），收集上清夜-80 ℃凍存備用，都由相應實驗室完成。以實驗室標準值為正常對照。1.3.2 sPD-1、sPD-L1蛋白表達 采用ELISA檢測RAU組患者及對照組健康人血清中sPD-1和sPD-L1水平，按照說明書進行操作。sPD-1、sPD-L1標準品的濃度依次為0、15、30、60、120、240 pg·m L-1。以空白孔調零，利用酶標儀讀取450 nm吸光度（A）值，根據繪制的標準曲線計算待測血清中sPD-1和sPD-L1的濃度。

1.4 統計學處理

采用SPSS 19.0軟件進行統計學分析，資料統計描述用均數±標準差或中位數（四分位間距）表示，兩組之間差異比較采用獨立樣本t檢驗或秩和檢驗，sPD-1、sPD-L1表達水平與RAU患者免疫功能狀況及臨床特征的相關性分析采用Pearson或Spearman相關分析，P<0.05認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 免疫檢測結果

流式細胞術檢測結果表明，RAU組患者CD4+水平低于正常值，差異具有統計學意義（P<0.05）（表1）；散射比濁法檢測結果表明，RAU患者IgM水平高于正常值，差異具有統計學意義（P<0.05）（表2）。

表 1 RAU患者細胞免疫檢測結果Tab 1 Cellular immune test results in patients with RAU

2.2 sPD-1、sPD-L1蛋白的表達情況

ELISA檢測結果（圖1）表明，對照組sPD-1、sPD-L1分布較為集中，未見極端值，整體呈正態性分布趨勢；RAU組sPD-1、sPD-L1整體呈非正態性分布，其中30例中有3例（2例輕型、1例皰疹型）升高趨勢較為明顯，RAU患者外周血血清中sPD-1、sPD-L1表達水平較對照組總體上表現為升高趨勢，但個體之間存在著差異。秩和檢驗分析表明，RAU患者的sPD-1及sPD-L1蛋白表達水平高于對照組，差異有統計學意義（Z1=-2.794，P1=0.005；Z2=-2.834，P2=0.005）。

表 2 RAU患者體液免疫檢測結果Tab 2 Humoral immune test results in patients with RAU

圖 1 RAU患者血清中sPD-1、sPD-L1蛋白的表達Fig 1 Expression of sPD-1, sPD-L1 protein in patients with RAU

進一步分析RAU不同臨床類型間的sPD-1及sPDL1的表達，結果顯示輕型、重型RAU患者的sPD-1及sPD-L1蛋白表達水平高于對照組，差異具有統計學意義（P<0.05），而皰疹型RAU患者與對照組無統計學差異（P>0.05）（表3）。

表 3 不同臨床類型RAU患者血清中sPD-1及sPD-L1蛋白的表達水平Tab 3 Expression level of sPD-1, sPD-L1 protein in RAU patients with different clinical features pg·m L-1

2.3 RAU患者sPD-1、sPD-L1表達量與免疫指標的相關性分析

Spearman相關分析表明，RAU患者sPD-1表達量與CD19+、C4存在正相關關系（r1=0.389，P1=0.034；r2=0.382，P2=0.037）；但sPD-L1表達量與細胞免疫和體液免疫指標均無相關關系（表4）。

表 4 RAU患者sPD-1、sPD-L1與免疫指標的相關性分析T ab 4 The correlate analysis between the expression of sPD-1, sPD-L1 and the immune system of RAU patients

3 討論

RAU是最常見的口腔黏膜疾病，是一種局限口腔黏膜的潰瘍性損害，患病率20%左右[1]。RAU具有周期性、復發性、自限性、灼痛明顯等特點，給患者帶來了很大的痛苦。RAU的病因及發病機制不明，推測其發生可能是機體在受到各種可疑致病因素如細菌、病毒或精神心理因素、激素的改變、生活不規律等的刺激下引發的異常免疫反應，致使口腔黏膜上皮局部發生免疫性的損傷、壞死而形成潰瘍。目前認為RAU患者免疫調節失衡是其發生的重要原因。機體免疫中，T淋巴細胞亞群主管細胞免疫，是細胞免疫的主力軍[8]，其功能主要取決于T淋巴細胞總值（CD3+）及其亞群（CD4+、CD8+）的相對組成。在本研究中RAU患者以CD4+降低最為明顯，提示在RAU的發作期，患者的細胞免疫功能處于低下狀態，這與其他學者[9]的研究結果一致。免疫功能低下很可能會導致機體對外來致RAU的抗原或者是超抗原的抵御能力變弱。體液免疫是通過B淋巴細胞產生的特異性免疫球蛋白來實現的，免疫球蛋白（Ig）可分為五類，即IgG、IgA、IgM、IgD、IgE。其中，IgM在免疫球蛋白中相對分子質量最大，是初次體液免疫應答中抗感染的“先鋒部隊”，通過與補體結合，可起到溶解細菌和溶解血細胞的作用。C3、C4是補體系統中含量最多、最重要的一個組分。在本研究中，與正常值相比，RAU患者IgM升高，提示患者體液免疫功能處于增強狀態。以上結果提示RAU發作期機體免疫狀態是不正常的，不僅有細胞免疫的低下，而且還有體液免疫功能的增強。

協同刺激分子家族的新成員PD-1/PD-L1是目前免疫學分子領域中研究的熱點，PD-1/PD-L1共刺激信號通過抑制下游細胞信號轉導通路，導致細胞周期停滯在G0/G1期，抑制T細胞增殖和細胞因子分泌，負性調控免疫應答，在維持免疫耐受中起重要作用[10-11]。正常生理調節下適量的PD-1/PD-L1信號通路能抑制T細胞增殖及細胞因子產生，從而調節T、B細胞的相互作用，限制自身反應性T細胞效應功能和靶器官的損害[12]，保護外周組織不受自身免疫對機體的攻擊；但如果PD-1/PD-L1通路提供的負信號強度過強，又會過度地抑制T細胞的增殖、活化，從而導致細胞免疫功能缺陷。sPD-1與PD-L1或者sPD-L1與PD-1結合都能夠影響PD-1/PD-L1信號通路，發揮免疫抑制作用。本研究結果顯示，RAU患者血清中sPD-1、sPD-L1水平均高于正常。推測，一方面可能由于RAU患者體內異常升高的sPD-1過多的與PD-L1結合阻斷了T淋巴細胞表面的PD-1與單核細胞、組織細胞等表面的PD-L1的結合，進而活化的CD4+T細胞逃避了PD-1/PD-L1的負性調控信號，導致T細胞持續活化、增殖，對自身抗原產生持續的免疫應答，發生自身組織損傷。另一方面可能由于RAU患者體內sPD-L1的異常增多與PD-1發生結合，使得抗原提呈細胞（antigen presenting cell，APC）細胞膜表面的PD-L1與T、B細胞表面的PD-1發生相互作用的頻率、概率顯著降低，進而活化T細胞不能及時獲得足夠強度的負性調控信號，導致T細胞過度活化增殖，對自身抗原引起持續的免疫反應，發生自身組織損傷[13]。本研究還進一步分析了RAU不同臨床類型間的sPD-1及sPD-L1的表達，結果顯示，輕型、重型RAU的sPD-1及sPD-L1蛋白表達水平都高于對照組（P<0.05），而RAU皰疹型與對照組差異無統計學意義，這可能與本研究皰疹型樣本量小有關。對RAU患者細胞免疫和體液免疫與sPD-1水平的相關性進行分析，結果顯示，sPD-1蛋白的高表達與RAU細胞免疫中CD19+、體液免疫中C4存在正相關關系（P<0.05）。加之上述免疫結果已經表明，RAU細胞免疫中CD4+細胞減少，RAU患者處于細胞免疫功能低下狀態。這提示：sPD-1的高表達可能促使RAU患者的體液免疫功能增強。其原因可能是sPD-1能夠參與血液循環，它們既能夠影響鄰近細胞又能夠和遠端細胞表面的受體相互結合，其發揮作用的廣度和深度甚至超過了細胞膜表面的分子。研究[14-15]表明sPD-L1促使細胞周期停滯于G1期并促進T淋巴細胞的凋亡，這與本研究中RAU患者的實際免疫結果相符合。因此，sPD-1、sPD-L1分子可能都參與了RAU疾病的發生。

綜上所述，本研究中RAU患者以細胞免疫功能低下為主，同時還伴有體液免疫功能的增強，且外周血中sPD-1和sPD-L1蛋白表達水平增高。sPD-1的高表達與CD19+、C4存在正相關關系，說明sPD-1蛋白的表達異常，其可能在一定程度上通過影響PD-1/ PD-L1信號通路抑制RAU的細胞免疫，同時誘發RAU的體液免疫增強，在RAU免疫發病機制中起著一定的作用，但其具體的作用機制尚有待進一步的研究證實。

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（本文編輯 李彩）

Soluble programmed death-1 and soluble programmed death ligand 1 protein expression and immune status in patients

with recurrent aphthous ulcer

Jiang Nan, Luo Liang, Liu Li, Sun Xiaoqin, Jiang Xing, Cai Yang. (Dept. of Periodontal and Oral Mucosal Diseases, The Affiliated Stomatological Hospital of Guizhou Medical University, Guiyang 550004, China)

Supported by: The National Natural Science Foundation of China (81460104). Correspondence: Cai Yang, E-mail: caiyang85 @163.com.

ObjectiveThis study aims to investigate the possible role and significance of soluble programmed death-1 (sPD-1) /soluble programmed death ligand 1 (sPD-L1) in the immune pathogeneses of recurrent aphthous ulcer (RAU). Methods A total of 30 RAU cases (18 cases of m inor RAU, 5 cases of major RAU, and 7 cases of herpetiform ulcers) were enrolled in this study. A total of 18 healthy people served as controls. Lymphocyte subsets (CD3+, CD4+, CD8+, CD19+, and CD16++56+) were investigated by flow cytometric analysis. Humoral immunity (IgG, IgA, IgM, C3, and C4) was explored by nephelometry immunoassay. The sPD-1 and sPD-L1 protein levels in the sera of RAU patients were investigated by enzyme-linked immunosorbent assay. The correlations of the sPD-1 and sPD-L1 protein levels with the immune status and clinical characteristics of the RAU patients were analyzed by SPSS 19.0.ResultsThe number of CD4+T cells decreased and the levels of IgM antibodies increased in the RAU patients relative to those in the normal controls (P<0.05). The sPD-1 and sPD-L1 protein levels in the RAU patients were significantly higher than those in the control group (P<0.05). Meanwhile, the sPD-1 and sPD-L1 protein levels in the patients with minor and major RAU were significantly higher than those in the control group (P<0.05). By contrast, no significant difference was found in the patients with herpetiform RAU (P>0.05). Positive correlations were noted between the sPD-1 protein level and the CD19+cell frequency or C4 level (r1=0.389, P1=0.034;

r2=0.382, P2=0.037).ConclusionCellular immune hypofunction and humoral immunity disorders were found in the RAU patients. The PD-1/PD-L1 signaling pathway, which m ight be influenced by the involvement of sPD-1 and sPD-L1 proteins to a certain extent, may play some roles in the immune pathogenesis of RAU.

recurrent aphthous ulcer; soluble programmed death-1; soluble programmed death ligand 1; immune

R 781.5

A

10.7518/hxkq.2017.03.011

2016-09-11；

2016-12-09

國家自然科學基金（81460104）

江南，碩士，E-mail：344248851@qq.com

蔡揚，教授，博士，E-mail：caiyang85@163.com