人牙源性多能干細胞重編程前后微小RNAs差異表達譜系分析

譚小兵戴青原

1.云南省第一人民醫院口腔內科；2.昆明醫科大學第一附屬醫院心內科，昆明 650032

人牙源性多能干細胞重編程前后微小RNAs差異表達譜系分析

譚小兵1戴青原2

1.云南省第一人民醫院口腔內科；2.昆明醫科大學第一附屬醫院心內科，昆明 650032

目的 對比研究兩種人牙源性多能干細胞重編程前后微小RNAs（m iRNAs）差異表達，交集分析、篩選特異性m iRNAs。方法 利用仙臺病毒將人牙髓干細胞（DPSCs）和根尖乳頭干細胞（SCAP）重編程為誘導性多潛能干細胞（iPSCs），提取總RNA，m iRNAs標記、雜交，掃描芯片、讀取圖像，篩選差異表達m iRNAs，交集分析。

結果 人DPSCs和SCAP均可重編程為iPSCs。m iRNAs芯片分析結果顯示人DPSCs重編程后有68個差異表達m iRNAs（倍數>10），其中37個表達上調，31個表達下調；人SCAP重編程后有107個差異表達m iRNAs（倍數>10），其中

68個表達上調，39個表達下調。二者取交集，均上調的有miR-302e，下調的有m iR-29b-3p、m iR-181b-5p、m iR-4328、

m iR-22-5p、m iR-145-5p、m iR-4324、let-7b-5p、m iR-181a-5p、m iR-27b-3p（倍數>10）。結論 人DPSCs和SCAP重編程為iPSCs過程中有多種m iRNAs參與，多數與細胞周期、上皮-間充質轉化、轉化生長因子β信號通路等相關。

誘導性多潛能干細胞； 牙髓干細胞； 根尖乳頭干細胞； 重編程； 微小RNAs

近十年來干細胞研究領域的突破性進展之一就是誘導性多潛能干細胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）的建立[1-2]。體細胞可通過多種方法重編程為iPSCs，主要分為病毒性載體和非病毒性載體，如RNA、微小RNAs（m icroRNAs，m iRNAs）轉染等[3]。學者[4]對iPSCs的復雜調節網絡、m RNA和m iRNAs進行了全基因組研究，其中引起更多關注的就是m iRNAs。m iRNAs通過降解靶mRNA或阻止蛋白合成以調節多種目標基因的表達。m iRNAs在各種細胞中均有表達，包括胚胎干細胞（embryonic stem cells，ESCs）、iPSCs和體細胞。通過對不同人ESCs、iPSCs的m iRNAs及mRNA表達的研究，發現了許多共同表達的m iRNAs簇，如m iR-290、 m iR-302-367等[5]。

本課題組前期研究將人牙髓干細胞（dental pulp stem cells，DPSCs）和根尖乳頭干細胞（stem cells form apical papilla，SCAP）重編程為iPSCs[6]，但重編程后DPSCs和SCAP的m iRNAs差異表達情況尚不清楚。為了更好地了解人牙源性干細胞重編程過程miRNAs的表達情況，本研究采用m iRNA芯片分析技術，比較人DPSCs和SCAP重編程后m iRNA差異表達情況，通過交集分析篩選幾種特異性表達m iRNAs，為進一步研究m iRNA在重編程中的作用機制提供實驗基礎。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器

α-最低必需培養基（minimum essential medium，MEM）、Ⅰ型膠原酶、異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）結合CD24/CD34/CD45/Stro-1、TRIzol試劑盒（Invitrogen公司，美國），胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）（Hyclone公司，美國），Ⅱ型中性蛋白酶（Roche公司，瑞士），2.5 g·L-1胰蛋白酶/0.25 mmol·L-1EDTA（Gibco公司，美國），PE結合CD90/CD105/CD146/Oct-4（eBioscience公司，美國），RNeasy M ini Kit RNA提取試劑盒（QIAGEN公司，德國），m iRNAs標記試劑盒m iRCURY? Hy3?/Hy5? Power labeling kit、miRNAs芯片雜交試劑盒miRCURYTMLNA Array（Exiqon公司，丹麥），NanoDrop ND-1000分光光度計（Thermo Fisher公司，美國），流氏細胞儀（Beckman公司，美國）、Axon GenePix 4000B芯片掃描儀（Axon公司，美國）。

1.2 人DPSCs 和SCAP體外分離培養及鑒定

收集云南省第一人民醫院口腔頜面外科因阻生拔除的下頜第三磨牙（患者年齡小于20歲），按照Gronthos等[7]的方法進行原代培養：收集牙髓和根尖乳頭組織，充分剪碎，3 mg·mL-1Ⅰ型膠原酶+4 mg·mL-1Ⅱ型中性蛋白酶消化液、37 ℃震蕩孵育60 m in，離心、棄上清，加入α-MEM完全培養基（α-MEM+ 15%FBS+1%谷氨酰胺+1%青/鏈霉素），過70 μm細胞濾器得到單細胞懸液，加入適量完全培養基，常規培養，第2~5代細胞用于實驗。本實驗所有操作均符合云南省第一人民醫院倫理委員會標準，取得患者書面同意。收集第3代DPSCs、SCAP，流式緩沖液吹打后加入10 μL相應抗體（CD24、CD34、CD45、CD90、CD105、CD146、Stro-1），室溫避光孵育30 m in；加入1%多聚甲醛，上機檢測。Oct-4、大鼠IgG2aK-PE同型對照流式抗體處理：4%多聚甲醛-磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）固定液、室溫避光孵育20 m in，1 500 r·m in-1離心5 min，棄上清，加入1×細胞打孔液，室溫避光孵育10 m in，同樣條件離心、棄上清，加入對應抗體10 μL，再加入杜氏磷酸鹽緩沖液（Dulbecco’s phosphate buffer saline，D-PBS）混勻，室溫避光孵育30 m in，加入1%多聚甲醛液，流氏細胞儀檢測，Summ it 5.1軟件分析數據。

1.3 人DPSCs、SCAP的重編程

按照CytoTune-iPS仙臺病毒重編程試劑盒說明書進行如下操作：轉染前2 d，將第3代人DPSCs、SCAP鋪到6孔板內（每孔1×105個），常規培養。轉染當天（第0天），將適量仙臺病毒（Sendai virus，SeV）溶解到70 μL牙干細胞培養基內開始轉染，1 d后（第1天）再加入130 μL牙干細胞培養基，第2天換新鮮含SeV培養液繼續轉染。第3天將已轉染細胞轉移到基質膠覆蓋6孔板內，重編程培養基繼續培養，3周左右可以觀察到克隆出現。克隆成熟時，“十字法”分割克隆，轉移到新培養板內（基質膠覆蓋），記為iPSCs第一代（P1），PSC-easy培養基（含10 μmol·L-1Y27632，選擇性ROCK1抑制劑）繼續培養，克隆90%融合時，Ⅳ型膠原酶消化傳代，4~ 5 d傳代一次。隨機挑選部分克隆進行長期培養觀察。常規培養人ESCs（H9，第55代）作為標準對照。

1.4 逆轉錄聚合酶鏈反應（reverse transcription poly- merase chain reaction，RT-PCR）鑒定人DPSCs- iPSCs和SCAP-iPSCs

收集DPSCs-iPSCs和SCAP-iPSCs（第12代），提取總RNA，5 μL RNA、逆轉錄試劑盒合成cDNA，反應條件：25 ℃ 5 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min，4 ℃保存。聚合酶鏈反應：95 ℃ 5 m in，35次循環（95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s），72 ℃ 7 min，電泳檢測、成像。檢測iPSCs特異性標記物Oct-4、Sox2、K lf4、c-M yc的表達，GAPDH為管家基因，水為陰性對照（引物序列見表1）。

表 1 iPSCs特異性標記物基因引物序列Tab 1 Base sequences of specific markers for iPSCs

1.5 人DPSCs、SCAP重編程前后m iRNAs差異表達分析

1.5.1 總RNA提取 常規培養人DPSCs、SCAP（第3代）和DPSCs-iPSCs、SCAP-iPSCs（第12代），90%融合時收集細胞，TRIzol試劑盒提取總RNA，RNeasy M ini Kit RNA提取試劑盒純化樣品，NanoDrop ND-1000分光光度計檢測RNA濃度。

1.5.2 RNA標記與芯片雜交 1）miRCURY? Hy3?/ Hy5? Power labeling kit試劑盒對樣品miRNAs進行標記：1 μL總RNA加水至2 μL，加入1 μL小牛腸磷酸酶緩沖液（calf intestine phosphartase，CIP）和CIP酶，混合后置于37 ℃下30 m in，95 ℃ 5 m in終止反應，再加3 μL標記緩沖液、1.5 μL免疫標記劑（Hy3?）、2.0 μL二甲基亞砜（dimethylsulfoxide，DMSO）、2.0 μL標記酶，16 ℃反應1 h，65 ℃ 15 m in終止反應；2）芯片雜交：將Hy3?標記樣品與m iRCURY?LNA Array雜交芯片雜交，Hy3?標記的全部25 μL混合物與25 μL雜交緩沖液混合，95 ℃變性2 m in，然后置于冰上2 m in，56 ℃雜交16~20 h（Nimblegen系統平臺，Roche公司，美國），清洗緩沖液試劑盒Wash buffer kit清洗芯片3次；3）Axon GenePix 4000B芯片掃描儀掃描芯片。

1.5.3 數據分析方法 使用GenePix Pro 6.0掃描分析軟件讀取芯片掃描圖像，并提取探針的信號值。相同的探針取中值合并。保留在所有樣品中均大于30.0的探針，對全部芯片進行中值標準化，篩選差異表達探針，繪制散點圖。

使用倍數變化和P值篩選兩組樣品間（有重復）的差異表達m iRNAs，使用倍數變化篩選兩個樣品間（沒有重復）的差異表達m iRNAs，最后進行交集分析。

2 結果

2.1 人DPSCs和SCAP原代培養及鑒定

2種細胞體外分離培養4 d形成克隆，10 d左右鋪滿培養瓶（圖1）。流式細胞儀檢測結果顯示，DPSCs、SCAP均不表達CD34、CD45，幾乎100% DPSCs、SCAP均為CD90、CD105陽性，CD146染色均為強陽性（分別為28.4%、54.8%），Stro-1（分別為28.3%、12.4%）、Oct-4（分別為43.6%、58.0%）染色均為陽性，僅SCAP表達CD24（10.9%）（圖2）。

圖 1 人DPSCs和SCAP原代培養 倒置相差顯微鏡 × 100 Fig 1 Primitive culture of human DPSCs and SCAP inverted phase contrast microscope × 100

圖 2 人DPSCs、SCAP特異性標記物的表達Fig 2 The expression of specific markers of human DPSCs and SCAP

2.2 人DPSCs-iPSCs、SCAP-iPSCs細胞重編程及鑒定

轉染細胞接種到基質膠，重編程培養3~4周后逐漸出現ES樣克隆，邊緣銳利清晰，此時ESCs樣克隆即為iPSCs原代細胞（P0，圖3）。

圖 3 人DPSCs-iPSCs、SCAP-iPSCs體外培養 倒置相差顯微鏡Fig 3 Culture of human DPSCs-iPSCs and SCAP-iPSCs in vitro inverted phase contrast m icroscope

RT-PCR結果顯示，重編程得到的iPSCs特異性表達干細胞標記物Oct-4、Sox2、K lf4、c-M yc與人ESCs細胞系H9相同，證明得到的為已完全重編程的iPSCs（圖4）。

圖 4 人牙源性iPSCs特異性標記物RT-PCR分析結果Fig 4 RT-PCR analyses for human iPSCs specific marker genes Oct-4, Sox2, K lf4 and c-M yc

2.3 人DPSCs和SCAP重編程前后m iRNAs差異表達分析

共分析了2 085個miRNAs，其中人DPSCs重編程后有68個差異表達m iRNAs（倍數>10），其中37個表達上調，31個表達下調；人SCAP重編程后有107個差異表達miRNAs（倍數>10），其中68個表達上調，39個表達下調；二者差異表達miRNAs取交集，結果發現人DPSCs和SCAP重編程后m iRNAs均上調的有m iR-302e，均下調的有m iR-29b-3p、m iR-181b-5p、miR-4328、miR-22-5p、miR-145-5p、miR-4324、let-7b-5p、m iR-181a-5p、m iR-27b-3p（倍數>10）（表2）。

表 2 人牙源性iPSCs重編程前后m iRNA差異表達交集（>10倍）Tab 2 Analysis of m icroRNAs differential expression intersections of human dental iPSCs before and after reprogramm ing (more than 10 fold)

3 討論

m iRNAs是一類在轉錄后水平對目的基因表達進行調控的非編碼RNA，在機體發育、細胞凋亡、體細胞重編程等方面都有極為重要的作用。早在1993年就發現了m iRNAs存在[8]，但近些年人們發現其在ESCs自我更新和多向分化中具有重要作用，m iRNAs在體細胞重編程過程中的機制研究方興未艾。

3.1 m iRNAs與多潛能性

m iRNAs可以調控ESCs的多潛能性、自我更新和分化。當m iRNAs必需的加工蛋白Dicer/Drosha和RNA結合蛋白DGCR8耗盡后，m iRNAs會全部缺失，進而導致ESCs體外分化和增殖能力的缺陷，Dicer缺陷小鼠在發育早期死亡[9]。研究[10]證實，ESCs可以表達特定m iRNAs簇，轉錄因子如Oct-4、Sox2和Nanog結合到m iRNAs啟動子，從而激發ESCs多個m iRNAs簇的表達。m iR-290簇包含多個種子序列與miR-302相同或相似的成熟m iRNAs，在ESCs中表達最為豐富，占未分化ESCs細胞m iRNAs的大多數。m iR-290簇其他成員（如m iR-291-3p、m iR-294、miR-295）與miR-302簇可以直接抑制細胞周期關鍵啟動子，屬于ESCs周期調節[11]。

m iRNAs不但可以維持ESCs的多潛能性，對其分化也起著重要的調節作用。ESCs誘導分化后某些miRNAs表達的特異性上調可以減少多潛能相關因子的表達，這是獲得分化亞型的先決條件。如m iR-296抑制Nanog的表達，m iR-134和m iR-470的靶基因為多潛能因子Nanog、Oct-4、Sox2[12]，m iR-200c、m iR-203和miR-183抑制Sox2和K lf4的表達[13]，m iR-145抑制Oct-4、Sox2、K lf4的表達[14]。誘導分化后多潛能相關因子如Lin28的表達下調使得m iRNAs無需再加工，從而促進let7家族成員的成熟，這對ESCs分化的調節非常重要[15]。m iR-34a通過激活Notch和轉移生長因子β（transforming grow th factor-β，TGF-β）信號通路，可促進SCAP成牙本質和成骨向分化[16-17]。m iR-224可通過調節離子轉運體的表達以維持微環境pH值平衡，從而促進釉質礦化。

3.2 m iRNAs與重編程

iPSCs最早是過表達轉錄因子Oct-4/Sox2/K lf4/c-Myc建立的[1]，其他4種轉錄因子Oct-4/Sox2/Nanog/ Lin28或2種組合也能誘導產生iPSCs[2,18]，iPSCs的miRNAs表達譜系與ES細胞特征相似[19]。

人們首次在小鼠胚胎成纖維細胞中過表達m iR-290及Oct-4/Sox2/Klf4以誘導iPSCs的產生，發現miR-291-3p、m iR-294、m iR-295能增加重編程效率，而m iR-290簇其他成員則無此功效，如m iR-292-3p、miR-293[20]。

m iR-302家族與m iR-290家族成員有共同的種子序列，同樣可以增加成纖維細胞的重編程效率，過表達人m iR-302、m iR-372與轉錄因子Oct-4/Sox2/ K lf4/c-Myc能促進人成纖維細胞多潛能性的誘導[12]。Anokye-Danso等[21]第一次發現無需其他轉錄因子，僅過表達m iR-302和m iR-367就能直接重編程小鼠和人體細胞，效率和速度均高于傳統方法。Liao等[22]發現過表達m iR-106a-363、m iR-302-367可以加速間充質-上皮轉化以增加iPSCs的誘導效率。直接轉染成熟的雙鏈m iR-200c、m iR-302、m iR-369也能獲得有效的重編程，此方法無需病毒載體，可提供更為安全的重編程方法。

最近研究[23]又發現了與m iR-302簇種子序列相同或相近的3個m iR簇，即m iR-17-92、m iR106b-25和m iR106a-363，過表達m iR-106b-25家族成員m iR-93和m iR-106b能促進iPSCs的誘導。最近一項無偏倚研究[24]篩選了379種miRNAs，進一步證實了miR-290、m iR-302、m iR-17和m iR-25簇也能夠促進重編程的效率。

人DPSCs和SCAP來源組織相近，細胞形態、增殖和分化能力相似，為了進一步了解這兩種細胞在重編程時的特點，本研究利用CytoTune-iPS仙臺病毒將人DPSCs和SCAP誘導為iPSCs，通過miRNAs芯片技術比較兩種來源體細胞重編程前后miRNAs的差異表達情況，再交集分析，成功篩選出10種特異性表達的miRNAs：m iR-302e（上調）、m iR-29b-3p、m iR-181b-5p、m iR-4328、m iR-22-5p、miR-145-5p、m iR-432、let-7b-5p、m iR-181a-5p、m iR-27b-3p（下調）。這些m iRNAs大多與細胞周期、TGF-β信號通路、上皮-間充質轉化有關。

3.3 m iRNAs與牙齒發育和再生

miRNA的正常表達對牙胚發育非常重要。M ichon等[25]通過m iRNA芯片技術研究發現，牙胚形成階段表達的m iRNA有m iR-140、m iR-31、m iR-875-5p和m iR141，而m iR-689、miR-720、m iR-711和miR-455在細胞分化階段表達，說明高RNA干擾（RNA interference，RNAi）通路活性和上皮m iRNA與牙齒發育息息相關，上皮m iRNA主要調節磨牙牙冠發育和牙尖形態。Kim等[26]通過m iRNA原位雜交研究發現，m iR-135a在牙胚發育蕾狀期時在牙源性上皮和間充質中高表達，而帽狀期和鐘狀期時僅在外釉上皮層、星網狀層、牙囊和牙乳頭中表達，內釉上皮層中無表達，進一步研究發現m iRNA-135a通過BMP信號通路調節牙齒形成。

m iRNAs促進或直接誘導重編程的機制尚不完全清楚，可能包括不同通路的靶向調節，如細胞周期和表觀調節，還有上皮-間充質轉化的調節，對本實驗發現的差異m iRNAs尚需要通過m iRNA靶基因預測、m iRNA-基因本體論（gene ontology，GO）和miRNA-生物通路富集分析等進一步研究以闡明其在人牙源性細胞重編程過程中的作用機制。

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（本文編輯 李彩）

Characterization of m icroRNAs profiles of induced p luripotent stem cells reprogrammed from human dental pulp stem

cells and stem cells from apical papilla

Tan Xiaobing1, Dai Qingyuan2. (1. Dept. of Oral Medicine, First People’s Hospital of Yunnan Province, Kunming 650032, China; 2. Dept. of Cardiology, First Affiliated Hospital of Kunming Medical University, Kunming 650032, China)

Supported by: The National Natural Science Foundation of China (81360161); Yunnan Provincial Department of Education Science Foundation of China (2015Y153). Correspondence: Dai Qingyuan, E-mail: dqy0823@163.com.

ObjectiveTo compare characterization of m icroRNAs (m iRNAs) expression profiles of induced pluripotent stem cells (iPSCs) reprogrammed from human dental pulp stem cells (DPSCs) and stem cells from apical papilla (SCAP) and screen-specific microRNA.MethodsHuman DPSCs and SCAP were reprogrammed into iPSCs using a Sendai virus vector. Total RNA of human DPSCs-iPSCs and SCAP-iPSCs were extracted. m iRNAs were labeled and hybridized. Slides were scanned, and images were imported into GenePix Pro 6.0 for grid alignment and data extraction. Significant differentially expressed m iRNAs between the two groups were identified using fold change and P-value and were analyzed.ResultsBoth human DPSCs and SCAP were successfully reprogrammed into iPSCs. Among miRNA genes analyzed by miRNA microarray, 68 were differentially expressed by more than 10-fold in DPSCs-iPSCs; 37 of these genes were up-regulated, and 31 were down-regulated. In SCAP-iPSCs, 107 genes were differentially expressed by more than 10-fold; 68 were up-regulated, and 39 were down-regulated. In both cells, only m iR-302e was up-regulated, whereas 9 m iRNAs were down-regulated: m iR-29b-3p, miR-181b-5p, miR-4328, miR-22-5p, m iR-145-5p, miR-4324, let-7b-5p, miR-181a-5p, and miR-27b-3p.ConclusionMultiple m iRNAs participated in reprogramm ing of human DPSCs and SCAP into iPSCs. Most m iRNAs are related to cell cycle, transforming grow th factor-β signaling pathways and epithelial-mesenchymal transition.

induced pluripotent stem cells; dental pulp stem cells; stem cells from apical papilla; reprogramm ing; m icroRNAs

R 781

A

10.7518/hxkq.2017.03.008

2016-08-11；

2016-12-09

國家自然科學基金（81360161）；云南省教育廳基金（2-015Y153）

譚小兵，副主任醫師，碩士，E-mail：txb042005@163.com

戴青原，副主任醫師，博士，E-mail：dqy0823@163.com