變異鏈球菌低pH感應系統的構建

康迪 李雨慶 周學東

口腔疾病研究國家重點實驗室，國家口腔疾病臨床研究中心，四川大學華西口腔醫院，成都 610041

·基礎研究·

變異鏈球菌低pH感應系統的構建

康迪 李雨慶 周學東

口腔疾病研究國家重點實驗室，國家口腔疾病臨床研究中心，四川大學華西口腔醫院，成都 610041

目的 構建變異鏈球菌低pH感應系統，原位可視地檢測其所處環境的pH。方法 通過聚合酶鏈反應（PCR）和基因重組技術，克隆得到唾液鏈球菌57.I的ureⅠ基因啟動子片段（pureⅠ）及綠色熒光蛋白（GFP）的編碼基因gfp，經過酶切后將兩個基因片段連接融合，然后再經雙酶切將融合片段與大腸桿菌-變異鏈球菌穿梭載體pDL278連接，構建出重組質粒pDL278-pureⅠ-gfp。將重組質粒轉化到變異鏈球菌UA159中，使用熒光顯微鏡觀察其在不同pH條件和不同處理時間的單位面積熒光強度。結果 目的基因pureⅠ和gfp擴增片段大小分別為450 bp和717 bp，與預期大小相符。構建的重組質粒pDL278-pureⅠ-gfp測序結果與數據庫比對完全一致。重組變異鏈球菌低pH報告菌株PCR擴增片段與預期結果相符。在一定范圍內，變異鏈球菌低pH感應系統單位面積熒光強度隨pH值的降低和處理時間的延長而增強。結論 本研究成功構建了變異鏈球菌低pH感應系統，同時驗證了唾液鏈球菌酸誘導啟動子pureⅠ能在變異鏈球菌中正常發揮功能，為今后研究菌斑生物膜中原位pH的動態變化提供了新方法。

變異鏈球菌； 唾液鏈球菌； 綠色熒光蛋白； 尿素酶； 啟動子

齲病是口腔常見的感染性疾病之一。牙菌斑生物膜的形成是齲病形成的首要因素，而變異鏈球菌則是牙菌斑中主要的致齲菌之一[1-2]。變異鏈球菌等產酸細菌通過分解糖類產酸，降低菌斑局部pH使牙面脫礦，最終形成齲損[3]。這些酸性代謝產物是造成牙齒脫礦最直接的原因[4]。目前，檢測菌斑基質中pH值主要采用pH染料、微電極等方法，但這些測量方法常為非原位測量的方法，易帶入其他混雜因素[4-5]。

唾液鏈球菌是口腔中的主要產堿菌，在酸性環境中可被誘導產堿，以調節環境pH[6-7]。產生此特性的分子機制是：在高pH環境下，CodY蛋白與尿素酶基因ureⅠ啟動子（promoter of ureaseⅠ，pureⅠ）結合，阻遏下游基因表達；在低pH環境下，CodY蛋白從pureⅠ上解離，啟動下游基因表達[6]。綠色熒光蛋白（green fluores-cence protein，GFP）常作為報告基團，用于監控細胞組織動態變化、基因表達、蛋白定位等[8]。本研究擬將pureⅠ與GFP編碼基因gfp連接并轉入變異鏈球菌中，構建變異鏈球菌低pH感應系統，從而原位指示變異鏈球菌所處環境的pH狀態，以準確探討菌斑生物膜中原位pH的動態變化。

1 材料和方法

1.1 材料

大腸桿菌-變異鏈球菌穿梭載體pDL278（四川大學口腔疾病研究國家重點實驗室提供）；限制性核酸內切酶BamHⅠ、SacⅠ和SalⅠ，T4 DNA連接酶（Takara公司，日本），KOD-Plus DNA聚合酶（Toyobo公司，日本）；細菌基因組DNA抽提試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒、柱式質粒小量抽提試劑盒（北京天根生化科技有限公司）；其余試劑均為國產或進口分析純試劑。實驗引物合成及DNA序列測定由上海生工生物工程股份有限公司完成。

1.2 菌種和培養基

唾液鏈球菌57.I、變異鏈球菌UA159、含有GFP編碼基因gfp的變異鏈球菌菌株（四川大學口腔疾病研究國家重點實驗室保存），大腸桿菌DH5α感受態細胞（北京天根生化科技有限公司）；腦心浸液（brain heart infusion，BHI）培養基及LB（Luria-Bertani）培養基（Sigma公司，美國）。50%BHI培養基配制方法：將BHI培養基與無菌水等體積混合，調節pH=7.5，使用0.22 μm孔徑濾器過濾。

1.3 引物

根據唾液鏈球菌基因組序列設計并合成pureⅠ特異性引物，其中上游引物包含SacⅠ的限制性酶切位點，下游引物包含BamHⅠ的限制性酶切位點；根據Clonetech公司的pGFP載體序列設計并合成gfp基因特異性引物，其中上游引物包含BamHⅠ的限制性酶切位點，下游引物包含SalⅠ的限制性酶切位點。引物序列如表1所示。

表 1 pureⅠ和gfp基因特異性引物Tab 1 Gene-specific primers for pureⅠand gfp

1.4 目的基因的擴增

將唾液鏈球菌及含有GFP編碼基因gfp的變異鏈球菌菌株分別接種于BHI培養基瓊脂平板，37 ℃厭氧培養箱內（體積分數10%H2，5%CO2及85%N2）培養24 h。挑取單菌落于BHI液體培養基中增菌過夜。4 000 r·m in-1離心10 m in收集細菌至1.5 m L EP管中。使用細菌基因組DNA抽提試劑盒，分別提取唾液鏈球菌以及含GFP編碼基因gfp的變異鏈球菌基因組DNA。分別以上述的DNA為模板進行聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增，反應條件：94 ℃預變性5 m in，進入熱循環（98 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，68 ℃延伸30 s），共35個循環，最后68 ℃再延伸8 m in。通過2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產物，DNA凝膠回收試劑盒回收PCR產物中的目的基因片段。

1.5 含目的基因重組質粒的構建與驗證

將擴增得到的目的基因片段用限制性核酸內切酶BamHⅠ酶切并使用2%瓊脂糖凝膠電泳及DNA凝膠回收試劑盒回收酶切后的目的基因片段。將回收后的目的基因片段用T4 DNA連接酶16 ℃連接16 h。使用1.5%瓊脂糖凝膠電泳對連接產物進行分析，并切取1 200 bp大小的條帶進行DNA回收。以回收產物作為模板，pureⅠ-SacⅠ及gfp-SalⅠ作為引物，PCR擴增融合連接體。反應條件：94 ℃預變性5 min，進入熱循環（98 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，68 ℃延伸1 m in），共35個循環，最后68 ℃再延伸8 min。將上述融合片段與質粒pDL278分別使用SacⅠ及SalⅠ雙酶切。將酶切產物進行瓊脂糖凝膠電泳后，使用DNA凝膠回收試劑盒回收酶切后的核酸片段。使用T4 DNA連接酶將上述兩片段在16 ℃下連接16 h。將連接產物轉化到大腸桿菌DH5α感受態細胞中，涂布含有100 μg·m L-1壯觀霉素的LB培養基瓊脂平板，37 ℃有氧條件下培養24 h，挑選陽性克隆，增菌培養，提取質粒進行PCR和測序驗證。驗證正確的重組質粒命名為pDL278-pureⅠ-gfp，并凍存留用。

1.6 變異鏈球菌低pH感應系統的構建

將變異鏈球菌UA 159接種于BHI培養基瓊脂平板，37 ℃厭氧培養箱內培養。1 d后傳代，經涂片鏡檢及生化鑒定后，再次傳代過夜培養。使用BHI培養基將菌液稀釋20倍，厭氧條件下培養至吸光度OD600值為0.2。取500 μL上述菌液置于無菌EP管中，加入變異鏈球菌感受態刺激肽（competence stimulating peptide，CSP）使其終質量濃度為1 μg·m L-1，37 ℃孵育10 m in。向上述菌液中加入pDL278-pureⅠ-gfp并使其終質量濃度為2.5 μg·m L-1，厭氧條件下培養2.5 h。取100 μL菌液涂布含有1 g·L-1壯觀霉素的BHI培養基瓊脂平板并于厭氧條件下培養。48 h后挑選壯觀霉素陽性克隆進行增菌培養。使用菌液進行PCR驗證，驗證正確的重組菌株加入甘油后于-80 ℃凍存。

1.7 變異鏈球菌低pH感應系統的驗證

將重組變異鏈球菌菌株接種于含有終質量濃度為15 g·L-1酸堿緩沖劑Pipes（Sigma公司，美國）和1 g·L-1壯觀霉素的50%BHI培養基中，37 ℃厭氧培養箱內培養過夜，菌液備用。將9個滅菌后的玻璃小圓片分別置于24孔板的9個孔內，并向其中加入2 m L上述混合培養液及20 μL上述菌液，37 ℃厭氧培養箱內培養14 h后，分別置于pH值為7.5、5.5、3.5的BHI培養基中處理1、30、60 m in。然后將各小圓片取出置于載玻片上，向小圓片中央滴加一滴無熒光鏡油，小心蓋上蓋玻片。于奧林巴斯正置熒光顯微鏡spgr-b通道下觀察上述樣本，每個樣本隨機選取5個視野并使用ImagePro-Plus計算其單位面積熒光強度，并使用SNK檢驗分析組間差異。

2 結果

2.1 目的基因擴增產物的鑒定及gfp和pureⅠ基因片段的連接

PCR產物瓊脂糖凝膠電泳結果顯示，在約700 bp和450 bp處分別有特異性單一PCR產物條帶，與預期大小（717 bp和450 bp）一致（圖1）。將上述基因片段通過BamHⅠ酶切位點酶切后連接，連接產物瓊脂糖凝膠電泳顯示，在約450、700、900、1 200、1 400 bp處均可見清晰條帶（圖2）。其中，1 200 bp處條帶大小符合預期?；厥赵摋l帶內DNA并將其作為模板，以pureⅠ-SacⅠ和gfp-SalⅠ為引物，行PCR擴增。擴增產物電泳結果顯示，在約1 200 bp處見特異性單一PCR產物條帶，與預期大小一致（圖3）。2.2 重組質粒pDL278-pureⅠ-gfp的構建和鑒定

將融合片段pureⅠ-gfp與載體pDL278通過SacⅠ及SalⅠ酶切位點雙酶切后連接，并將連接體系轉化入大腸桿菌感受態細胞DH5α中，涂布壯觀霉素抗性平板，挑選陽性菌落，增菌后提取質粒。重組質粒及其PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳結果顯示，約7 900 bp處可見特異性條帶，與預期重組質粒大小一致（圖4），在約1 200 bp處可見特異性單一PCR產物條帶，與pureⅠ-gfp融合片段預期的大小一致（圖4）。經過對該PCR產物進行DNA序列測定和比對，確定該融合片段的DNA序列與數據庫中的序列100%一致。

圖 1 gfp和pureⅠ基因PCR擴增產物Fig 1 PCR products of gfp and pureⅠ genes

圖 2 gfp和pureⅠ基因的連接產物Fig 2 Connection products of gfp and pureⅠgenes

圖 3 gfp和pureⅠ基因融合片段的PCR擴增產物Fig 3 PCR products of the connected segment of gfp and pureⅠ genes

圖 5 重組變異鏈球菌PCR驗證產物瓊脂糖凝膠電泳結果Fig 5 Agarose gel electrophoresis results of PCR products of recom- binant Streptococcus mutans

2.3 變異鏈球菌低pH報告菌株的構建及鑒定

將經驗證的重組質粒轉化入經誘導的變異鏈球菌細胞中，涂布壯觀霉素抗性平板，共挑選出6株變異鏈球菌壯觀霉素陽性克隆，PCR產物瓊脂糖凝膠電泳結果顯示，6個樣本均在約1 200 bp處可見特異性單一PCR產物條帶，與pureⅠ-gfp融合片段預期大小一致（圖5）。

圖 4 重組質粒及其PCR驗證產物瓊脂糖凝膠電泳結果Fig 4 Agarose gel electrophoresis results of recombinant plasm ids and PCR products

2.4 變異鏈球菌低pH報告菌株感應不同pH能力比較

為了驗證變異鏈球菌低pH報告菌株感應不同pH的能力，本研究分別對比了在pH值為7.5、5.5、3.5以及處理時間為1、30、60 m in時變異鏈球菌低pH報告菌株的單位面積熒光強度。不同pH和處理時間變異鏈球菌低pH感應系統熒光圖片見圖6，單位面積熒光強度統計圖見圖7。

圖 6 不同pH和處理時間變異鏈球菌低pH感應系統熒光圖 熒光顯微鏡 × 100Fig 6 The scene of the low-pH-sensing system in different pH and different processing time fluorescence microscope × 100

當pH為7.5和5.5時，隨處理時間的延長，單位面積熒光強度明顯升高（P<0.05）；當pH值為3.5時，處理1 min與30 min單位面積熒光強度無明顯差異（P> 0.05），但均較處理60 min時低（P<0.05）。不同pH處理相同時間時，單位面積熒光強度隨pH值的降低而升高（圖7）。

圖 7 不同pH和處理時間變異鏈球菌低pH感應系統單位面積熒光強度統計圖Fig 7 Fluorescence intensity statistical figure of the low-pH sensing system in different pH and different processing time

3 討論

變異鏈球菌是牙菌斑生物膜中的重要成員，該菌能夠代謝糖類產酸，降低局部pH，抑制其余細菌（如血鏈球菌）的生長，在競爭中逐漸成為優勢菌。同時變異鏈球菌具有耐酸性，可以在低pH的環境中正常生長，并且產生更多的酸，使環境始終處于低pH狀態[9-10]。牙菌斑生物膜形成迅速且較難清除，其中的微生物代謝產生的乳酸等酸性物質不易流出亦不易被唾液中和，故可造成牙菌斑底部附著牙面的局部長期低pH環境[1]。齲病的發生就始于局部低pH環境造成的牙體脫礦。由此可見，相對于細菌本身而言，其產酸造成的菌斑附著表面的低pH環境才是齲病發生的直接因素。如何直觀準確地反映菌斑pH顯得尤為重要。本實驗構建的低pH感應系統以致齲微生物——變異鏈球菌作為報告菌，可用于與齲相關的微生物及微生態研究，不帶入其他影響因素，使用范圍廣。

目前，生物膜pH的測量方法大致有以下幾種。1）接觸式電極測量法[5]：將微電極插入待測部位進行探測。2）取樣檢測法[5]：將待測部位菌斑收集起來，再通過pH計進行檢測。這兩種方法簡單、便宜、靈活，但具有測量時會擾亂待測部位生物膜，測試時間不連續，唾液緩沖作用影響大，非原位檢測等缺點。3）內在電極測量法[5]：將微電極事先置于未形成生物膜的物體表面（如義齒基托、培養皿底部等），然后置于患者口內或接入細菌，即可通過無線電技術連續長期地檢測pH。這種方法不擾亂生物膜的形成且為原位檢測，但其價格昂貴、操作復雜。4）pH染料法[11-12]：使用商品化的pH熒光染料對生物膜進行染色和檢測。此方法中pH染料染色的操作易受生物膜厚度和表面粗糙程度等因素的影響，造成實驗誤差?？傮w來說，生物膜pH的測量方法不盡如人意，研究者們渴望尋得一種方便、廉價、連續原位測量且誤差較小的測量方法。本實驗構建的變異鏈球菌低pH感應系統，于生物膜原位檢測pH，檢測方法操作簡單，可最大程度還原生物膜局部的真實pH高低狀態，減少人為因素帶入的影響。

唾液鏈球菌尿素酶編碼基因ureⅠ的啟動子pureⅠ酸誘導性強，機制較清楚。CodY蛋白與RNA聚合酶競爭pureⅠ上的結合位點，而pH的高低則決定CodY蛋白與結合位點的結合與解離[6]。本課題組發現，變異鏈球菌中的CodY蛋白與唾液鏈球菌中的CodY蛋白高度同源，且有研究者將該啟動子轉入格氏鏈球菌中并驗證了該啟動子在鏈球菌屬其他菌種中也可以正常發揮酸誘導特性[13]。Li等[14]的研究中展望了使用該啟動子連接一段報告基因以制作生物膜pH探針的應用前景。GFP具有熒光穩定，非種屬特異，不影響細胞正常生理功能，可用于活細胞直接觀測等特點，其編碼基因常被作為報告基因用于啟動子功能驗證，報告菌株構建，蛋白質定位以及分泌的檢測等[8,15-17]，也曾被用于變異鏈球菌中研究gtfB基因的表達調控[18]。故本實驗將啟動子pureⅠ與gfp基因連接轉入變異鏈球菌中，從而構建受環境pH調節熒光強弱的變異鏈球菌低pH報告系統。該系統感受環境pH的受體位于核酸層面，調控精度高，從而提高了此系統的準確性。

本研究在變異鏈球菌低pH感應系統的驗證中發現，培養14 h后的生物膜樣本已檢測出較弱熒光，但熒光強度明顯低于處理后。筆者認為，造成此現象的原因可能是：1）由于變異鏈球菌代謝產酸，雖已使用50%BHI培養基降低營養，并于培養基中加入酸堿緩沖劑Pipes，但經檢測培養14 h后培養基仍處于弱酸性；2）質粒在變異鏈球菌中為多拷貝狀態，而變異鏈球菌基因組codY基因為單拷貝。變異鏈球菌產生的CodY蛋白不足以在接近中性pH的環境下將pureⅠ啟動子完全阻遏，故仍可有GFP的合成。本課題組后期實驗計劃將融合片段pureⅠ-gfp整合到變異鏈球菌基因組中，以期具有更精確靈敏的pH感應作用。

綜上所述，本研究成功構建了變異鏈球菌低pH感應系統。該系統可在一定的范圍內原位反映生物膜局部pH狀態，具有一定的應用前景。同時，本研究驗證了唾液鏈球菌尿素酶基因的啟動子pureⅠ在變異鏈球菌中可以正常發揮酸誘導功能，為日后進一步將該啟動子應用于變異鏈球菌基因表達調控的相關研究提供了理論基礎。

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（本文編輯 吳愛華）

Construction of a low-pH-sensing system in Streptococcus mutans

Kang Di, Li Yuqing, Zhou Xuedong. (State Key Laboratory of Oral Diseases, National Clinical Research Center for Oral Diseases, West China Hospital of Stomatology, Sichuan University, Chengdu 610041, China)

ObjectiveTo construct a low-pH-sensing system in Streptococcus mutans (S. mutans) and to visually detect the pH in situ.MethodsPromoter of ureaseⅠ(PureⅠ) and green fluorescence protein (gfp) DNA fragments were amplified by polymerase chain reaction (PCR) from the genome of Streptococcus salivarius 57.I and S. mutans containing the gfp fragment. The two amplified DNA fragments were ligated together and further integrated into pDL278 to construct the recombinant plasm id pDL278-pureⅠ-gfp. This recombinant plasm id was then transformed into S. mutans UA159 cells. Subsequently, the intensity of the optical density per unit area of the low-pH-sensing system was measured and compared under different pH conditions and different processing times.ResultsPureⅠ and gfp DNA fragments were amplified successfully with the correct molecule sizes (450 and 717 bp, respectively). The recombinant plasmid pDL278-pureⅠ-gfp was constructed and further verified by PCR and sequencing. The intensity of the optical density per unit area of the low-pH-sensing system increased with decreasing pH and increasing processing time.ConclusionA low-pH-sensing system was constructed successfully in S. mutans. Our research verified that pureⅠ of Streptococcus salivarius can function well in S. mutans as an acid induced promoter, and provided a new method of detecting the pH of plaque biofilms in situ.

Streptococcus mutans; Streptococcus salivarius; green fluorescence protein; urease; promoter

R 780.2

A

10.7518/hxkq.2017.03.003

Supported by: National Natural Science Foundation of China (81430011, 31200985). Correspondence: Zhou Xuedong, E-mail: zhouxd@scu.edu.cn.

2016-10-25；

2016-12-12

國家自然科學基金（81430011，31200985）

康迪，博士，E-mail：juejiangkang@gmail.com

周學東，教授，博士，E-mail：zhouxd@scu.edu.cn