P16基因甲基化和P53抗體在非小細胞肺癌血清中的表達

萬玲玲 賀宇彤 李玉雪 李立新 梁蕓 顏騰飛

·論著·

P16基因甲基化和P53抗體在非小細胞肺癌血清中的表達

萬玲玲 賀宇彤 李玉雪 李立新 梁蕓 顏騰飛

目的 探討P16基因甲基化和P53抗體在人非小細胞肺癌血清中的表達。方法 選擇98例NSCLC患者為試驗組(NSCLC組)，60例健康者血清作對照(對照組)，分別采用巢式甲基化特異性聚合酶鏈反應法及用酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測其血清P16基因甲基化和P53抗體表達情況。結果 NSCLC組患者血清中P16甲基化和P53抗體與對照組分布差異有統計學意義(P<0.01)；有吸煙史的P16基因甲基化表達率和P53抗體水平高于無吸煙史患者(P<0.01)；病理為鱗癌的患者的P16甲基化的危險度是病理為腺癌或其他的2.724(1.087～6.826)倍(P<0.01)；P16基因甲基化與P53抗體在NSCLC血清中的表達具有相關性。結論 P16基因甲基化和P53抗體的表達與NSCLC發生密切相關，且吸煙有協同作用；P16基因甲基化與P53抗體在NSCLC的表達有相關性。

P16；DNA甲基化；P53；抗體；非小細胞肺癌；巢氏甲基化特異性PCR法

肺癌是全球常見的惡性腫瘤，其死亡率、發病率在世界范圍的腫瘤性疾病中居于首位，已經成為我國城市人口惡性腫瘤死亡原因的第一位，非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)包括鱗狀細胞癌、腺癌、大細胞癌，與小細胞癌相比其癌細胞生長分裂較慢，擴散轉移較晚[1]。NSCLC約占所有肺癌的80%，約75%患者發現時處于晚期，5年生存率很低。肺癌發生是多階段、多步驟的共同作用的結果，而抑癌基因的失活是其中非常重要的機制[2]，P16基因和P53基因均為最重要的抑癌基因，P16基因甲基化和P53基因突變使其各自的抑癌基因失活造成肺癌發生。NSCLC遺傳機制所引起的作用日益受到重視，尤其是抑癌基因在其中的作用，本實驗分別采用巢式甲基化特異性聚合酶鏈反應法及ELISA法研究P16基因甲基化和P53抗體在NSCLC血清中的表達，以探討P16基因和P53基因與NSCLC的發生的關系，為肺癌的診斷提供依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 所有受檢者均為石家莊市第一醫院2013年1月至2014年12月入院的98例原發性NSCLC患者(NSCLC肺癌組)，其中男72例，女26例；年齡22～83歲，平均年齡(62.06±10.92)歲；全部原發性NSCLC患者臨床診斷均經影像學和病理學證實，其中鱗癌(squamous cell carcinoma, SCC)47例，腺癌(adenocarcinoma)及其他51例，肺癌按照TNM臨床分期，Ⅰ～Ⅱ期72例，Ⅲ期26例，無0期及Ⅳ期病例；對照組60例，男32例，女28例；平均年齡(61.14±12.89)歲；均為排除惡性腫瘤等疾病的健康體檢者。2組性別比、年齡差異無統計學意義(P>0.05)。收集相關流行病學資料，包括一般情況、生活習慣(如吸煙、飲酒、飲茶等)、疾病家族遺傳史。

1.2 方法

1.2.1 標本收集：手術或者放、化療前收集非小細胞肺癌患者血液標本5～10 ml，于低溫離心，分離血清，-70℃保存。

1.2.2 基因啟動子區甲基化檢測：按QIAamp Blood Kit操作步驟提取血清DNA，采用巢式甲基化特異性PCR檢測P16基因啟動子區甲基化狀態，檢測方法如下：

1.2.2.1 硫酸氫鹽修飾：將CPG序列中未甲基化的胞嘧啶轉變為尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不發生變化。修飾過程：取含DNA溶液50 μl，加入4 mol/L的NaOH至終濃度為0.2 mol/L,37℃變性10 min。加入30 μl新配制的10 mmol/L的氫醌及520 μl，pH值5.0的3 mol/L的NaHSO3，表面覆蓋礦物油，避光置于50℃水浴16 h,然后利用Wizard DNA純化試劑盒(美國Promega公司)純化修飾后DNA。于室溫下加入4 mol/L的NaOH至終濃度為0.3 mol/L,放置5～20 min,脫硫。最后加入1/10體積的3 mol/L乙酸鈉及冰乙醇沉淀DNA，室溫下干燥。加適量TE(pH值8.0)溶解，-20℃保存。

1.2.2.2 巢式甲基化特異性PCR檢測(德國Biometra公司PCR儀)：參照相關文獻設計兩對引物，分別為P16基因甲基化引物(有意義鏈5’-TTATTAGAGGGTGGGGCG2GATCGC和反義鏈5’-GACCCCGACCGCGACCGTTA,擴增片段長度為150 bp)、P16基因非甲基化引物(有意義鏈5’-TATTAGAGGGTGGGGTGGATTGT和反義鏈5’-CAACCCCAAACCACAACCATAA,擴增長度片段為(151 bp)。反應總體積50 μl，經NaHSO3修飾的模板DNA約50 ng，各引物300 ng，dNTP為1.25 mmol/L，1×PCR緩沖液(16.6 mmol/L硫酸銨，67 mmol/L Tris-HCl，pH值8.8,6.7 mmol/L MCl2，10 mmol/L 2-巰基乙醇)。第一輪PCR使用外側引物，反應條件為95℃熱啟動10 min，加入1.0 U TaqDNA聚合酶(美國Promega公司)，然后于95℃、60℃、72℃各30 s循環40次。最后于72℃延伸10 min。將第一輪PCR產物適當稀釋(50倍)，取10 μl進行第二輪PCR反應，退火溫度增加到65℃，反應時間減少為15 s，其他條件與第一輪相同。同時以正常人外周血淋巴細胞(PBL)DNA 作陰性對照。人移行細胞膀胱癌細胞株(T-24)的P16基因啟動區是高甲基化的，以它作為陽性對照，擴增完成后取10 μl PCR產物，用2.5%的瓊脂糖凝膠進行電泳，溴化乙錠染色，用凝膠成像分析進行拍照分析。

1.2.3 P53抗體的檢測方法：P53抗體檢測試劑采用德國IBL公司P53-Autoantibodies酶聯免疫吸附反應試劑盒，應用酶聯免疫吸附反應法的實驗原理，嚴格按照德國IBL公司P53-Autoantibodies酶聯免疫吸附反應試劑盒說明書進行。反應試劑盒說明書進行：洗滌、包被好微孔反應板，將稀釋樣品、原倍標準品、稀釋標本、陰性對照各100 μl分別加入相應微孔內，封板，室溫孵育1 h；洗板5次，拍干；每孔加入酶標抗體100 μl，避光，室溫30 min；每孔加2 mol/L HCl 50 μl,終止反應。酶標儀450 nm處測吸收光度，按以下公式計算P53抗體[P53抗體指數=A450 nm(樣品)-A450 nm(低值標準)/A450 nm(高值標準)-A450 nm(低值標準)]。

2 結果

2.1 2組P16基因甲基化和P53抗體表達情況 NSCLC組患者血清中P16甲基化檢出69例，陽性率70.41%，對照組中P16甲基化的陽性率為15.00%，差異有統計學意義(χ2=45.709，P<0.001)。NSCLC組患者中P53抗體平均水平為(4.113±6.040)U/ml，陽性率58.16%，對照組中P53抗體平均水平(0.220±0.028)U/ml，NSCLC組P53抗體水平高于對照組，差異有統計學意義(Z=-5.786，P<0.01)。見表1。

表1 2組研究對象血清中P16甲基化和P53抗體檢測結果比較

2.2 P16基因甲基化的相關影響因素分析 有吸煙史(≥400支/年)的P16基因甲基化率高于無吸煙史(<400支/年)，差異有統計學意義(χ2=5.317，P=0.021)，有吸煙史的人群P16甲基化的危險度是無吸煙史的2.813(1.151～6.875)倍。病理分型為鱗癌的患者中，38例檢測出有P16基因甲基化陽性，陽性率為80.85%，高于其他病理分型，差異有統計學意義(χ2=4.727，P=0.030)，病理為鱗癌的患者P16甲基化的危險度是病理為腺癌或其他的2.724(1.087～6.826)倍。其他相關因素比較陽性率差異均無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 P16基因甲基化的相關影響因素分析

2.3 P53抗體表達相關影響因素分析 根據P53抗體95%參考區間0.002～0.330 U/ml。以≥0.330 U/ml正常上限為陽性。有吸煙史的患者的P53抗體表達陽性率為72.13%，高于無吸煙史的患者，差異有統計學意義(χ2=12.954，P<0.001)。其他相關的臨床特征因素比較顯示P53抗體表達差異均無統計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 P53抗體表達相關影響因素分析

2.4 P16基因甲基化與P53抗體表達關聯性分析 P16基因甲基化陽性患者的P53抗體水平為4.424±5.748，陽性率為65.22%，P16基因甲基化陰性患者的P53抗體水平為3.375±6.735，陽性率為58.62%。P16基因甲基化陽性患者的P53表達水平高于陰性患者，差異有統計學意義(Z=-2.012，P=0.044)；P16基因甲基化與P53抗體定性的聯系數為0.215，P=0.029，表示P16基因甲基化與P53抗體表達具有相關性。見表4。

表4 P16基因甲基化與P53抗體表達關聯性分析

3 討論

表觀遺傳學研究表明，腫瘤的形成往往伴有抑癌基因的失活，P16基因位于人類染色體的9q21區，其編碼蛋白為P16,其基因啟動子區域CPG島異常甲基化修飾導致基因失活已經成為肺癌診斷研究熱點之一[3]，P16基因是直接作用于細胞周期，抑制細胞增殖，具有減慢細胞周期的“剎車”作用[4]，當P16基因由于甲基化而失活時，可導致PRB基因持續磷酸化，細胞增殖失控而形成腫瘤[5]。P53基因位于人類染色體的17q13區,腫瘤抑制基因P53基因突變是惡性腫瘤中最常見的基因突變，編碼為P53的蛋白P53基因有野生型與突變型，血清P53抗體是機體對突變型P53蛋白產生免疫應答的產物[6]，研究表明P53抗體的生物學意義與P53基因相同，它的表達與腫瘤發生密切相關，P53抗體在血中非常穩定，研究資料表明它是腫瘤發生過程中的早期事件[7]。

本研究中，我們采用巢式甲基化特異性聚合酶鏈反應法研究P16基因甲基化在NSCLC中的表達，顯示P16基因甲基化在NSCLC的血清中發生率為70.41%，高于對照組，兩者差異有統計學意義(P<0.01)，這與以往研究結果[8]相似，提示P16基因甲基化是NSCLC中常見的分子事件，很可能是NSCLC發生的重要原因之一；本研究結果得出病理類型中鱗癌患者血清P16基因甲基化明顯高于其他類型NSCLC(P<0.01)，與Nakata等[9]的結果相似，表明CPG島甲基化的發生存在著組織學特異性；我們采用酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測其血清P53抗體，顯示P53抗體在NSCLC的血清中高于對照組，兩者差異有統計學意義，這與韓毅等[10,11]得出結果一致，有研究表明肺癌患者P53基因突變很普遍，在NSCLC中突變率可以達50%[12]，提示P53基因突變也是NSCLC重要的分子事件，可能參與了NSCLC的發生。本研究中對P16基因甲基化和P53抗體表達關聯性分析得出結論為P16基因甲基化陽性患者的P53表達水平高于陰性患者，差異有統計學意義(Z=-2.012，P=0.044)；P16基因甲基化與P53抗體定性的聯系數為0.215，P=0.029，表示P16基因甲基化與P53抗體表達具有相關性，這有可能提示NSCLC機制里存在發生有多種抑癌基因同時失活的協同作用。

大量的流行病學證據顯示，過量的使用煙草已經成為肺癌的確定性危險因素[13]，87%的肺癌由吸煙引起，吸煙是也是NSCLC的主要危險因素之一，香煙中含有7,8-二羥9,10環氧苯并芘(BPDE)等致癌物，BPDE-DNA加合物在甲基化的CPG位點與非甲基化的CPG位點分布區別很大，有研究表明甲基化的CPG更容易受BPDE等化學致癌物的攻擊[14]。本研究發現NSCLC患者有吸煙史的人群P16甲基化的危險度是無吸煙史的2.813倍，并且與無吸煙史相比有顯著性差異，這與汪亞松等[15]發現肺癌相關基因甲基化與吸煙高度相關相似。說明吸煙與P16基因甲基化與P53抗體水平對NSCLC檢測成正相關。本結果顯示P53抗體檢測也同樣在吸煙患者組中檢出率高，這與吸煙與P53基因突變風險存在線形相關性的研究結果一致，并且吸煙越多[16]，肺癌患者P53突變率越高。本研究發現P16基因甲基化和P53抗體與NSCLC患者的年齡、性別、臨床分期、飲酒、遺傳、飲茶無明顯相關性。

綜上所述，我們對P16基因甲基化和P53抗體在NSCLC中的研究，使我們對NSCLC發生的機制有了更深一步的了解，P16基因甲基化和P53抗體表達在NSCLC中是普遍現象，并且均為NSCLC發生的早期事件，因此將P16基因甲基化與P53抗體聯合應用于肺癌的早期篩查、診斷有積極的意義。但是對于P16基因甲基化和P53抗體的很多問題尚需解決，如何更方便、更準確的檢測P16基因甲基化和P53抗體，P16基因甲基化和P53基因突變具體發生的機制以及其調控因子的關系還有待于進一步研究。

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Expression of p16 gene methylation and p53 antibody in serum of patients with non-small cell lung cancer

WANLingling*,HEYutong,LIYuxue*,etal.

*DepartmentofClinicalLaboratory,TheFirstHospitalofShijiazhuangCity,Shijiazhuang050000,China

Objective To investigate the expression of P16 gene methylation and P53 antibody in serum of patients with non-small cell lung cancer (NSCLC).Methods Ninety-eight patients with NSCLC were selected as experimental group and 60 healthy subjects were served as control group. The expression levels of P16 gene methylation and P53 antibody were detected by methylation-specific PCR (MSP) and ELISA,respectively.Results There were significant differences in P16 gene methylation and p53 antibody expression between experimental group and control group (P<0.01). The expression levels of P16 gene methylation and P53 andibody in patients with smoking history were significantly higher than those of patients without smoking history (P<0.01). The risk of P16 methylation in patients with squamous cell carcinoma was 2.724 (1.087～6.826) times as high as that of patients with adenocarcinoma or other cancers (P<0.01). The P16 methylation was correlated to the expression of P53 antibody in NSCLC.Conclusion The P16 methylation and P53 antibody expression are closely correlated to the occurrence of NSCLC, moreover, smoking has a synergistic effect with them. The P16 methylation is related with expression of P53 antibody in NSCLC.

P16; DNA methylation; P53; antibodies; non-small cell lung cancer; MSP

10.3969/j.issn.1002-7386.2017.12.006

項目來源：石家莊市科學技術研究與發展指導計劃項目(編號：131462693)

050011 河北省石家莊市第一醫院檢驗科(萬玲玲、李玉雪、李立新、梁蕓)；河北醫科大學第四醫院腫瘤研究所(賀宇彤)；河北醫科大學2015級研究生(顏騰飛)

R 734.2

A

1002-7386(2017)12-1783-05

2017-02-21)