HPLC法測(cè)定芪連通絡(luò)膠囊中天麻素的含量*

王艷艷，劉長河

(河南省中醫(yī)藥研究院，河南 鄭州 450004)

·藥學(xué)研究·

HPLC法測(cè)定芪連通絡(luò)膠囊中天麻素的含量*

王艷艷，劉長河

(河南省中醫(yī)藥研究院，河南 鄭州 450004)

目的：建立芪連通絡(luò)膠囊中天麻素的HPLC含量測(cè)定方法。方法：采用C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)，以乙腈-0.5 mL/L磷酸溶液(1∶99)為流動(dòng)相,檢測(cè)波長220 nm,柱溫40 ℃,體積流量1.0 mL/min。理論板數(shù)按天麻素峰計(jì)算應(yīng)不低于3 000。結(jié)果：天麻素在0.082 ～0.410 μg 間線性良好，r=0.999 5(n=5)。天麻素平均加樣回收率為99.5%(RSD=1.84%,n=6)。結(jié)論：所建立的測(cè)定方法準(zhǔn)確可靠，簡便易行，重現(xiàn)性好，能夠很好的開展該制劑的定量控制。

芪連通絡(luò)膠囊；天麻素含量測(cè)定；HPLC法

芪連通絡(luò)膠囊為山西臨汾中醫(yī)院的醫(yī)院制劑，由雪蓮花、天麻、黃芪、黨參、地龍組成，具有補(bǔ)益腎氣、活血通絡(luò)的功效，臨床用于中風(fēng)的治療，效果良好。天麻為處方中重要藥物，臨床和實(shí)驗(yàn)研究[1-3]表明，天麻中所含的天麻素具有鎮(zhèn)痛、安眠、鎮(zhèn)靜等中樞抑制作用，能增加腦血流量，改善椎基底動(dòng)脈供血不足，保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞。本研究選擇天麻素作為指標(biāo)性成分，對(duì)芪連通絡(luò)膠囊中的天麻素進(jìn)行含量測(cè)定，以便更好地控制制劑的內(nèi)在質(zhì)量。

1 藥品、試劑與儀器

芪連通絡(luò)膠囊樣品，臨汾中醫(yī)院制劑室生產(chǎn)，批號(hào)分別為160130，160131，160132。天麻素對(duì)照品，供含量測(cè)定用，中國藥品生物制品檢定所提供，批號(hào)110807-201306。乙腈，高效液相用色譜純，美國DIKMA公司產(chǎn)品，批號(hào)R141048；水為重蒸水，其余試劑均為分析純。LC-10A液相色譜系統(tǒng)，日本島津公司產(chǎn)品。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

參照參考文獻(xiàn)[1]方法。色譜柱為依利特C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動(dòng)相為乙腈- 0.5 mL/L磷酸溶液(1∶99)，體積流量1.0 mL/min，柱溫40 ℃，檢測(cè)波長220 nm，進(jìn)樣體積10 μL，理論板數(shù)按天麻素峰計(jì)應(yīng)不低于3 000。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取天麻素對(duì)照品2.05 μg，置50 mL量瓶中，加流動(dòng)相制成1 mL含天麻素 41 μg的溶液，作為對(duì)照品溶液。

2.3 供試品提取方法研究和供試品溶液的制備

取批號(hào)為160130的芪連通絡(luò)膠囊內(nèi)容物適量，研細(xì)，混勻，精密稱取6份，每份約0.5 g，精密稱定，各加入稀乙醇溶液25 mL，1-4號(hào)分別超聲處理提取30，60，90，120 min，5-6號(hào)分別加熱回流提取1，2.5 h。濾過，取濾液進(jìn)樣10 μL測(cè)定天麻素的含量。結(jié)果：1-6號(hào)樣品天麻素含量分別為1.68，1.70，1.72，1.72，1.72和1.73 mg/g。結(jié)果提示：超聲、回流提取的天麻素量基本一致，超聲提取60，90，120 min基本可將天麻素提取完全。考慮到超聲處理方法簡便易行，選擇超聲提取60 min的方法提取供試品溶液。

取本品內(nèi)容物適量，混勻，研細(xì)，取約0.5 g，精密稱定，置50 mL三角瓶中，準(zhǔn)確加入稀乙醇溶液25 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理(功率350 W，頻率40 kHz)1 h，放冷，再稱定質(zhì)量，用稀乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，精密吸取續(xù)濾液5 mL，蒸干，殘?jiān)昧鲃?dòng)溶液相適量使溶解，并轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，用流動(dòng)相溶液稀釋至刻度，搖勻，0.45 μm微孔濾膜濾過，取濾液，即得。

2.4 線性關(guān)系的考察

分別精密稱取2.2項(xiàng)下的天麻素對(duì)照品溶液2，4，6，8，10 μL，進(jìn)樣測(cè)定其峰面積，以天麻素進(jìn)樣量(μg)為縱坐標(biāo)(Y)，以峰面積積分值為橫坐標(biāo)(X)，計(jì)算回歸方程，繪制天麻素的標(biāo)準(zhǔn)曲線。回歸方程為：Y=5.305 53×10-7X+2.633 21×10-3，r=0.999 5。結(jié)果表明：天麻素進(jìn)樣量在0.082～0.410 μg 之間，峰面積積分值(X)與天麻素的進(jìn)樣量(Y)呈良好的線性關(guān)系。

2.5 陰性對(duì)照試驗(yàn)

取芪連通絡(luò)膠囊處方中除天麻外的其他藥物，按處方比例，按其工藝制成不含天麻的空白制劑，按2.3項(xiàng)下方法制備缺天麻陰性樣品。分別取天麻素對(duì)照品溶液、芪連通絡(luò)膠囊供試品溶液、缺天麻陰性樣品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件下進(jìn)樣分析。結(jié)果：供試品溶液色譜中，在與天麻素對(duì)照品色譜相同保留時(shí)間處有相應(yīng)的吸收峰出現(xiàn)，且分離良好；缺天麻陰性樣品色譜中，在與天麻素對(duì)照品色譜相同保留時(shí)間處沒有相應(yīng)的吸收峰出現(xiàn)，提示方中除天麻外的其他藥物對(duì)測(cè)定無干擾，見圖1。

A.天麻素對(duì)照品；B.芪連通絡(luò)膠囊供試品；C.缺天麻陰性樣品

2.6 精密度試驗(yàn)

取批號(hào)為160130的芪連通絡(luò)膠囊樣品，按2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣5次，測(cè)定峰面積。結(jié)果：天麻素的峰面積RSD值(n=5)為0.21%。結(jié)果表明：儀器精密度較好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取批號(hào)為160130的芪連通絡(luò)膠囊樣品，照2.3項(xiàng)下方法，制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件分別于供試品溶液制備完成0，1，2，4，6，7 h測(cè)定測(cè)得天麻素峰面積RSD值(n=6)為0.68%。結(jié)果表明：供試品溶液于7 h內(nèi)穩(wěn)定性較好。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

取批號(hào)為160130的芪連通絡(luò)膠囊樣品，按2.3項(xiàng)下方法制備6份供試品溶液，在2.1項(xiàng)色譜條件下測(cè)定。結(jié)果：樣品中天麻素的平均含量為0.852 mg/粒(RSD=1.66%，n=6)。結(jié)果表明：天麻素測(cè)定的重復(fù)性較好。

2.9 加樣回收率試驗(yàn)

取天麻素含量已知的芪連通絡(luò)膠囊(批號(hào)為160130，含量按0.883 mg/粒、即1.765 1 mg/g計(jì))內(nèi)容物適量，研細(xì)、混勻，稱取6份，每份約0.25 g，精密稱定，分別準(zhǔn)確加入含有0.092 g/L天麻素稀乙醇溶液5 mL和稀乙醇溶液20 mL，按2.3項(xiàng)下方法制備加樣回收率供試品溶液，按2.1項(xiàng)下方法測(cè)定，計(jì)算天麻素的加樣回收率。結(jié)果：天麻素加樣回收率分別為99.78%、99.02%、101.16%、100.55%、100.27%和95.57%。結(jié)果表明：天麻素平均加樣回收率為99.5%(RSD=1.84%，n=6)。

2.10 樣品測(cè)定

分別取批號(hào)為160130，160131，160132的芪連通絡(luò)膠囊適量，除去囊殼，研細(xì)，混勻，分別按2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，測(cè)定并計(jì)算出芪連通絡(luò)膠囊中天麻素的含量。結(jié)果：3批樣品的測(cè)定結(jié)果分別為0.870，0.763和0.883 mg/粒(n=3)。

3 討 論

3.1 供試品溶液制備方法研究

根據(jù)天麻素的理化性質(zhì)，采用稀乙醇為溶劑對(duì)芪連通絡(luò)膠囊中天麻素進(jìn)行提取。據(jù)文獻(xiàn)[5-6]報(bào)道，使用超聲和回流提取均能較好地提取出天麻素。筆者在實(shí)驗(yàn)中分別比較了超聲處理和加熱回流兩種提取方式，并比較了不同的提取時(shí)間，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇超聲處理1h提取供試品溶液。所選供試品溶液的處理方法操作簡便、準(zhǔn)確可靠。

3.2 色譜條件的選擇

天麻為《中國藥典》2015版一部收載品種[7]。本實(shí)驗(yàn)在選擇色譜條件時(shí)參照了《中國藥典》中規(guī)定的HPLC法，對(duì)色譜流動(dòng)相中乙腈與磷酸溶液的不同配比進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)。文中所選流動(dòng)相比例峰型對(duì)稱，保留時(shí)間適宜，與雜質(zhì)峰可良好分離，基線平穩(wěn)。

本文采用與《中國藥典》一致的HPLC法建立芪連通絡(luò)膠囊中天麻素的含量測(cè)定方法，可豐富該制劑的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)，有助于提高制劑的臨床有效性，可為含天麻的復(fù)方制劑的定量質(zhì)控提供參考。

[1]葉靖宇.天麻素注射液聯(lián)合高壓氧治療椎基底動(dòng)脈供血不足療效觀察[J].中國社區(qū)醫(yī)師(醫(yī)學(xué)專業(yè))，2012,14(11):63-64.

[2]聶晶，杜亮，陸遠(yuǎn)富，等.天麻素對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡的抑制作用[J].重慶醫(yī)學(xué)，2012,41(18)：1841-1842.

[3]徐紀(jì)偉，陳旭東，劉喜民，等.天麻素對(duì)大鼠脊髓損傷后神經(jīng)元的保護(hù)作用[J]. 時(shí)珍國醫(yī)國藥，2011，22 (3) :568 -569.

[4]國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典：一部[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010:54.

[5]劉輝,張婧,樊光輝，等.HPLC法測(cè)定天麻素緩釋片中天麻素的含量[J].中國藥師，2013,16(6)：825-827.

[6]樊莉,周世文.黃芪天麻膠囊的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[J].中國藥房，2013,24(35)：3314-3317.

[7]國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典：一部 [M].北京：中國醫(yī)藥出版社，2015：58-59.

(編輯 陶 珠)

1001-6910(2017)04-0078-03

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10.3969/j.issn.1001-6910.2017.04.33

2012年度河南省重點(diǎn)科技攻關(guān)計(jì)劃(122102310060)

2016-12-28；

2017-02-09