昆侖雪菊提取物對STZ誘導的糖尿病大鼠胰島素抵抗的作用研究*

舒 暢，范 強，楊麗霞，姜良恩，張邦能，康萬榮，張延英，萬生芳

(1.甘肅中醫藥大學，甘肅 蘭州 730000； 2.甘肅省中醫藥研究院，甘肅 蘭州 730050；3.甘肅省中醫院，甘肅 蘭州 730050)

·實驗研究·

昆侖雪菊提取物對STZ誘導的糖尿病大鼠胰島素抵抗的作用研究*

舒 暢1，范 強1，楊麗霞2，姜良恩1，張邦能3，康萬榮1，張延英1，萬生芳1

(1.甘肅中醫藥大學，甘肅 蘭州 730000； 2.甘肅省中醫藥研究院，甘肅 蘭州 730050；3.甘肅省中醫院，甘肅 蘭州 730050)

目的：觀察昆侖雪菊提取物對STZ誘導的糖尿病大鼠胰島素抵抗的作用。方法：將35只雄性STZ誘導的糖尿病Wistar大鼠隨機分為模型對照組,昆侖雪菊提取物低、中、高劑量組,吡咯列酮組5組，每組7只；另選7只SPF級雄性Wistar大鼠為正常對照組。正常對照組和模型對照組灌服生理鹽水，昆侖雪菊低、中、高劑量組分別按100，200，400 μg/(g·d)劑量灌胃，吡咯列酮組灌服吡咯列酮10 μg/(g·d),連續4周。實驗室檢測大鼠空腹血糖、餐后2 h血糖及血脂水平，采用ELISA法檢測大鼠胰島素分泌水平(INS)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白介素1(IL-1)、白介素6(IL-6)、細胞間黏附分子1(ICAM1)、纖溶酶原激活物抑制劑(PAI1)、單核細胞趨化因子1(MCP1)，HE染色胰腺組織并光鏡下觀察胰島結構。結果：昆侖雪菊提取物對降低糖尿病大鼠體質量作用不明顯(P>0.05)，但對空腹血糖、餐后2 h 血糖具有降低作用，并在一定程度上能夠促進胰島素分泌，下調炎癥因子ICAMI、PAI1、MCP1、IL-6的表達，與模型對照組對比，差別有統計學意義(P<0.05)。HE染色顯示各藥物組具有保護胰島β細胞、延緩胰島衰竭的作用。結論：昆侖雪菊提取物在一定程度上具有降低2型糖尿病大鼠血糖、促進胰島素分泌、改善胰島素抵抗的作用,其作用機制可能與下調炎癥因子表達有關。

昆侖雪菊提取物/藥效學；STZ；糖尿病大鼠模型；血糖；胰島素抵抗；動物；大鼠

昆侖雪菊，民間又稱“血菊”，植物學名是蛇目菊、金雞菊(Coreopsis)，菊科金雞屬，一年生草本植物的干燥頭狀花序。它主要分布在我國新疆和田地區海拔高3 000米左右的昆侖山區，因此而得名昆侖雪菊，是一種與雪蓮齊名，具有獨特功效的稀有野生高寒植物，具有相當高的藥用價值，被當地居民作為花茶飲用，被當地醫院作為一種維藥材使用，具有清熱解毒、活血化瘀、和胃健脾的功效，可治療燥熱煩渴、高血壓、心慌、胃腸不適、食欲不振、痢疾及瘡疔腫毒，是一種具有廣闊的市場前景和研究價值的新品種藥材[1]。臨床上，雪菊花及復方制劑可用于預防、治療呼吸系統、泌尿生殖系統何皮膚等的感染性疾病，以及高血壓、高血脂癥等[2]。目前有研究表明，昆侖雪菊中總黃酮含量顯著高于市售菊花，且酚類化合物單體組成更加豐富，含量亦相對較高，具有較高的研究和開發價值[3-4]。近年來，市場上將雪菊主要作為降低血糖、血壓、血脂的保健品進行銷售。為了明確其藥理作用，本課題采用STZ誘導的糖尿病大鼠模型，通過觀察昆侖雪菊提取物對糖尿病大鼠血糖、血脂、血清炎癥因子和胰島素抵抗的作用，闡明其對糖尿病的作用及藥理機制，旨在為糖尿病的治療提供一種新方法。

1 材料與方法

1.1 動 物

70只SPF級雄性Wistar大鼠，體質量(200±20)g，購于甘肅中醫藥大學，許可證號：SCXK(甘)2004-0006。飼養于甘肅中醫藥大學屏障級動物實驗室，每天自由飲水、攝食。

1.2 藥品、試劑與儀器

昆侖雪菊，產地青海，購于青海優潤堂商貿有限責任公司，由上海友思生物技術有限公司提取；鹽酸吡格列酮片，北京太洋藥業有限公司產品，批號130605。鏈脲佐菌素(STZ)，Sigma公司產品，批號046K1206。ELISA試劑盒：胰島素(INS，批號CSB-E05070r)、MCP-1(批號CSB-E07429r)、PAI1(批號CSB-E07948r)、ICAM1(批號CSB-E04576r)，均為CUSABIO公司產品；TNF-α(批號DKW12-3720-096)、IL-1(批號DKW12-3012-048/DKW12-3012-096)、IL-6(批號DKW12-3036-096)，均為達科為生物技術有限公司產品；羅氏活力型血糖試紙，德國Roche Diagnostics GmbH公司產品。Accu-Chek Active [Model GC]血糖儀，德國Roche Diagnostics GmbH公司產品；2700型全自動生化儀，日本奧林巴斯公司產品；Bio-rad 680型酶標儀，美國伯樂公司產品。

1.3 糖尿病大鼠模型的建立與給藥

大鼠適應性飼養1周后，除正常對照組7只外，其余大鼠均給予高糖高脂飼料喂養，8周末尾靜脈注射STZ 25 μg/(g·d)，l周后尾靜脈取血測定血糖。隨機血糖穩定>13.9 mmol/L者診斷為2型糖尿病，未成功模型追加25 μg/(g·d) STZ 1次。選取造模成功的大鼠35只，隨機分為模型對照組，昆侖雪菊提取物低、中、高劑量組，吡格列酮組5組，每組7只。正常對照組和模型對照組灌服生理鹽水，昆侖雪菊提取低、中、高劑量組分別按100，200，400 μg/(g·d)的劑量灌胃，吡咯列酮組灌服10 μg/(g·d)劑量的吡咯列酮。灌胃量為10 μL/g，所有藥品以生理鹽水配成所需的質量分數，1 d 1次，連續4周。

1.4 檢測指標

4周后，禁食8 h，稱量體質量，麻醉后，一次性心臟采血，頸椎脫位處死后，取胰腺組織。血液靜置2 h，4 ℃、3 500 r/min離心20 min，取血清，-20 ℃保存；胰腺組織以40 g/L 甲醛固定，常溫保存。

1.4.1 大鼠一般情況、血糖、血脂

觀察大鼠精神狀態、活動狀況、毛色等一般情況，并稱量體質量，測空腹血糖(FPG)、餐后2 h血糖(P2hPG)和血清總膽固醇(CHOL)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)。

1.4.2 大鼠血清INS水平及炎癥因子ICAMI、PAI1、MCP1、TNF-α、IL-1、IL-6

根據試劑盒說明書進行，檢測前先對所有樣本進行低溫離心，在反應孔中加標準品或待測標本，每孔劑量為100 μL。在空白對照孔中加入稀釋液，劑量為100 mL；在37 ℃電熱培養箱中進行孵育，孵育后對檢測板進行洗滌；加酶標抗體進行酶聯免疫反應。反應終止后，將檢測板在酶標儀上進行檢測，以空白對照孔調零，檢測條件為450 nm，測定各孔OD值。

1.4.3 胰腺組織形態

HE染色，光鏡下觀察胰島形態結構。

1.5 統計學方法

2 結 果

2.1 各組大鼠一般情況對比

正常對照組大鼠皮毛光澤，精神狀態良好，動作反應靈敏，行為活躍。模型對照組大鼠皮毛干枯無光澤，精神狀態較差，動作遲緩，反應較慢，活動度差，并隨著飼養時間程度加重。昆侖雪菊提取物各劑量組和吡格列酮組與模型對照組對比，上述情況有不同程度的改善。

2.2 各組大鼠體質量、血清FPG、P2hPG、INS水平對比

與正常對照組對比，模型對照組大鼠的體質量降低，FPG與P2hPG升高，INS水平降低，差別有統計學意義(P<0.05)。與模型對照組對比，昆侖雪菊各劑量組大鼠體質量變化不明顯，但FPG與P2hPG有不同程度的降低，其中高劑量作用顯著，并且能顯著促進胰島素的分泌，差別有統計學意義(P<0.05)。見表1。

組 別劑量/(μg·g-1)體質量/gFPG/(mmol·L-1)P2hPG/(mmol·L-1)INS/(μIU·L-1)正常對照組—432.1±43.14.30±0.206.05±0.4390.03±18.72模型對照組—220.0±28.5*26.20±3.80*30.90±1.60*19.41±19.36*吡咯列酮組10231.4±41.025.45±7.3323.95±3.19#43.44±57.10#昆侖雪菊低劑量組100239.4±51.618.34±7.1127.74±3.8235.30±35.70#昆侖雪菊中劑量組200244.4±37.416.73±4.97#25.93±4.2439.37±42.38#昆侖雪菊高劑量組400238.3±32.016.91±7.33#23.65±6.77#42.53±49.67#

注：與正常對照組對比，*P<0.05；與模型對照組對比，#P<0.05。

2.3 各組大鼠血清CHOL、TG、HDL、LDL水平對比

與正常對照組對比，模型對照組大鼠CHOL、TG升高，差別有統計學意義(P<0.05)。昆侖雪菊提取物低、中、高劑量及吡咯列酮組的 CHOL、TG較模型對照組有一定下降趨勢，HDL、LDL較之變化不大。表明：昆侖雪菊提取物對糖尿病大鼠血脂指標作用不明顯。見表2。

組 別劑量/(μg·g-1)CHOL/(mmol·L-1)TG/(mmol·L-1)HDL/(mmol·L-1)LDL/(mmol·L-1)正常對照組—1.51±0.230.88±0.240.96±0.170.27±0.02模型對照組—2.08±0.17*1.48±0.63*1.34±0.060.36±0.09吡咯列酮組101.84±0.371.20±0.661.25±0.200.28±0.13昆侖雪菊低劑量組1001.84±0.500.77±0.351.31±0.390.28±0.07昆侖雪菊中劑量組2001.81±0.33#0.71±0.63#1.22±0.270.35±0.19昆侖雪菊高劑量組4001.65±0.26#0.62±0.31#1.16±0.200.32±0.06

注：與正常對照組對比，*P<0.05；與模型對照組對比，#P<0.05。

2.4 各組大鼠血清炎癥因子ICAM1、PAI1、MCP1、TNF-α、IL-1、IL-6對比

與正常對照組對比，模型對照組大鼠血清ICAMI、PAI1、MCP1、TNF-α、IL-6水平升高，差別有統計學意義(P<0.05)；IL-1升高不明顯，差別無統計學意義(P>0.05)。與模型對照組對比，4個藥物組炎癥因子ICAMI、PAI1、MCP1、IL-6水平下降，差別有統計學意義(P<0.05)，而TNF-α、IL-1水平較之差別無統計學意義(P>0.05)。結果表明：昆侖雪菊提取物對糖尿病大鼠血清炎癥因子ICAMI、PAI1、MCP1、IL-6在一定程度上具有抑制作用。見表3。

組 別劑量/(μg·g-1)ICAM1/(μg·L-1)PAI1/(μg·L-1)MCP1/(ng·L-1)TNF-α/(ng·L-1)IL-1/(ng·L-1)IL-6/(ng·L-1)正常對照組—99.39±5.310.33±0.8588.82±23.68104.4±10.8444.19±1.6765.43±5.61模型對照組—173.6±202.4*8.84±8.95*172.0±78.84*131.9±44.1346.54±2.73120.3±102.1*吡咯列酮組1096.80±10.49#3.85±1.55#111.3±26.25#109.2±14.9051.67±14.183.58±44.59#昆侖雪菊低劑量組10095.12±7.83#3.31±2.75#111.85±36.5#129.1±41.5144.19±2.8168.92±20.16#昆侖雪菊中劑量組20092.84±5.19#3.87±3.11#90.81±30.96#124.6±13.5644.59±1.0796.47±33.08#昆侖雪菊高劑量組40093.70±4.55#4.73±5.74#88.65±22.39#136.3±41.5045.09±1.3487.99±20.30#

注：與正常對照組對比，*P<0.05；與模型對照組對比，#P<0.05。

2.5 各組大鼠胰腺組織形態對比

正常對照組大鼠胰島邊界清楚，結構完整，外部形態豐滿，胰島細胞分布均勻，各細胞核呈橢圓形，胞漿豐富，胰島數量及島內細胞數均較多。模型對照組大鼠胰島數量減少，體積變小，邊界不清，胰島細胞胞漿減少，細胞核固縮。各藥物組均有不同程度的改善。見圖1。

A.正常對照組；B.模型對照組；C.吡咯列酮組；D.昆侖雪菊低劑量組；E.昆侖雪菊中劑量組；F.昆侖雪菊高劑量組

3 討 論

糖尿病的發病因素很多，發病機制復雜，目前大量研究表明胰島素抵抗(insulin resistance，IR)是糖尿病的發病基礎。IR是指胰島素作用的靶器官對胰島素的敏感性下降，產生的生物學效應低于正常狀態，胰島素的作用沒有很好地發揮出來。IR與很多代謝性疾病如高血壓、高血脂、糖尿病、痛風等有關，是這些疾病的共同病理生理基礎。因此，研究改善胰島素抵抗對于預防糖尿病等許多慢性代謝性疾病意義重大。

目前，現代醫學在治療胰島素抵抗方面存在著許多瓶頸問題尚未解決，其中患者不能長期耐受藥物的副作用是最常見的問題，此外還有藥物的不良反應及長期服用所產生的耐藥性等等；因此，純天然植物藥物的開發和應用具有很大的優勢和廣闊的市場前景。許多純天然植物中含有黃酮類化合物，其中許多是藥食兩用植物。在國外，很多食品添加劑或營養補充劑就是黃酮類化合物，黃酮類化合物與化學藥物相比具有較高的安全性，適合患者長期服用。大量研究表明，植物黃酮類化合物在改善胰島素抵抗方面具有顯著療效，已研究發現有蕎麥花葉總黃酮、玉米須總黃酮、葛根黃酮等黃酮苷藥物具有降血糖、改善胰島素抵抗的功效，有些已用于臨床[6-8]。因此，將黃酮類化合物開發成為改善胰島素抵抗、治療糖尿病的藥物，具有良好的應用前景。昆侖雪菊是純天然野生植物中含黃酮類化合物較高的植物，昆侖雪菊中水溶性總黃酮含量平均為18.62%[1]，水溶性總黃酮主要包括黃酮、黃酮醇、二氫黃酮、查耳酮及異黃銅類化合物[9]；醇溶性總黃酮含量為12.28%[10]，無查耳酮類化合物。研究發現，雪菊提取物內大量的黃酮類化合物具有抗氧化、擴張冠狀動脈-抗心肌缺血、降血壓、抑制艾滋病毒、抗癌等生物活性和藥理作用[9]。近年來雖然開展了一些有關昆侖雪菊化學成分的研究，但其藥理作用研究仍然不足，很多研究尚處于初級階段，生物活性物質基礎尚未明確，使其臨床應用受到限制，這對于我國中藥材資源的開發十分不利；因此，非常有必要加快對該藥材的藥用價值研究，并闡明其化學成分和藥理活性，以便于開發出療效確切、穩定的新藥。

本研究結果顯示：昆侖雪菊提取物對降低糖尿病大鼠體質量作用不明顯；與模型對照組相比，在灌胃4周后，對糖尿病大鼠的空腹血糖、餐后2 h血糖有降低作用；均具有促進胰島素分泌，增強胰島素敏感性的作用；對糖尿病大鼠血清炎癥因子ICAMI、PAI1、MCP1、IL-6降低作用明顯，對TNF-α、IL-1具有降低趨勢，但無統計學差異，說明昆侖雪菊提取物對糖尿病大鼠血清炎癥因子在一定程度上具有抑制作用。HE染色結果顯示：昆侖雪菊提取物具有保護胰島β細胞、延緩胰島功能衰竭的作用。結果表明：昆侖雪菊提取物在一定程度上具有降低糖尿病大鼠血糖、改善胰島素抵抗的作用，但由于藥物的純度較低，灌胃的時間較短，藥效發揮并非理想，這需要在以后的研究中進一步改善。本研究僅限于動物實驗，缺乏作用機制及臨床的深入研究，這將成為本課題以后的研究重點，以期能夠為糖尿病的治療提供更為有效的藥物。

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(編輯 陶 珠)

1001-6910(2017)03-0066-05

R587.1

B

10.3969/j.issn.1001-6910.2017.03.31

舒暢(1978-)，女(漢族)，重慶人，副教授，碩士,主要從事中醫藥防治糖尿病的研究。

楊麗霞，副主任醫師，博士,13038770310@163.com

國家自然科學基金(81202971)；甘肅省自然科學基金項目(編號1308RJZA106)；蘭州市科技局項目(2014-1-20)

2016-08-15；

2017-01-17