RNA干擾Livin基因對甲狀腺乳頭狀癌的增殖及侵襲抑制作用及其分子機制

薛棟　靳繼海　夏修良　王建強　王雯　成丕光　李新軍　鞏本剛

【摘要】 目的：探討Livin對甲狀腺乳頭狀癌TPC-1細胞增殖、凋亡及侵襲的影響以及可能的調控分子機制。方法：構建靶向Livin基因的慢病毒shRNA載體，轉染甲狀腺乳頭狀癌細胞株TPC-1，實驗分為干擾組、陰性對照組和空白組。應用RT-PCR和Western印跡檢測轉染Livin-shRNA后細胞Livin mRNA和蛋白表達水平的變化。應用MTT、流式細胞儀、Western印跡與Transwell侵襲實驗檢測Livin對甲狀腺乳頭狀癌細胞增殖、凋亡及侵襲的影響。并接種于裸鼠模型中，進一步確定Livin在體內對甲狀腺乳頭狀癌細胞的影響。結果：慢病毒Livin-shRNA載體成功抑制TPC-1細胞中Livin mRNA和蛋白的表達；轉染Livin-shRNA后TPC-1細胞的增殖能力受到明顯抑制（P<0.01），轉染Livin-shRNA組、陰性對照組和空白組的凋亡率分別為（15.72±0.21）%，（4.54±0.13）%和（4.87±0.22）%，三組比較差異均有統計學意義（P<0.01）。干擾組穿膜細胞數明顯少于陰性對照組和空白組（P<0.05）。與空白組和陰性對照組相比，干擾組細胞AKT、p-AKT及PDK1蛋白表達量均下調（P<0.05），而PTEN蛋白明顯上調（P<0.05）。甲狀腺乳頭狀癌裸鼠模型結果表明干擾組腫瘤的生長速度、腫瘤質量[（1.11±0.08）g]明顯小于空白組[（1.90±0.15）g]和陰性對照組[（2.10±0.12）g]。結論：沉默Livin基因能抑制甲狀腺乳頭狀癌細胞的增殖、侵襲及體內生長，促使甲狀腺乳頭狀癌細胞凋亡的發生，可能是通過抑制PI3K-AKT信號轉導通路來發揮作用。

【關鍵詞】 甲狀腺腫瘤； Livin； RNA干擾； 侵襲； 遷移； 動物模型

Inhibition on Proliferation and Invasion of Human Thyroid Papillary Cancer Cells by RNA Interference Livin Gene Expression and Its Possible Molecular Mechanism/XUE Dong，JIN Ji-hai，XIA Xiu-liang，et al.//Medical Innovation of China，2017，14（14）：004-008

【Abstract】 Objective：To investigate the effect of Livin on the proliferation，apoptosis and invasion of human thyroid papillary cancer cell line TPC-1，and its possible molecular mechanism.Method：Livin was silenced by using RNA interference.In this experiment，three groups were designed：the experimental group，the negative control group and the blank control group.The expression of Livin at mRNA and protein levels were detected by reverse transcription PCR and Western blot respectively.MTT，FCM，transwell and Western blot were utilized to analyze the result and specific molecular mechanism of Livin on TPC-1 cancer cells by transfected.The expressions of AKT，p-AKT，PDK1 and PTEN in TPC-1 cells were detected after transfection.Nude mice models inoculated TPC-1 cells were used to further clarify the effect of Livin on thyroid papillary cancer cells in vivo.Result：The stable Livin silencing cells line was successfully established.The expression of Livin at mRNA and protein levels was reduced significantly（P<0.05），leading to the inhibition of cell proliferation in the experimental group compared with the negative control group and the blank control group（P<0.05）.The apoptosis index of tumor cells in the above three groups were （15.72±0.21）%，（4.54±0.13）% and （4.87±0.22）%，respectively.Compared to the negative control group and the blank control group，the experimental group was significantly increased（P<0.01）.The transwell chamber assay showed that transmembrane cells of the experimental group were less than the negative control group and the blank control group after incubation 48 hours.Meanwhile，western blot analysis revealed that cells with stably knock-down of Livin showed decreased expression levels of AKT，p-AKT and PDK1 compared to the negative control group and the blank control group，but PTEN was highly expressed（P<0.05）.Nude mice models indicated that the growth and weight （1.11±0.08）g of the experimental group were significantly lower than （1.90±0.15）g of the blank control group and （2.10±0.12）g of the negative control group（P<0.05）.Conclusion：Scilencing the expression of Livin can inhibit the proliferation of thyroid papillary cancer cell and growth in vivo，and then accelerate the apoptosis of TPC-1 cancer cells by cutting down the activity of PI3K-AKT signal pathway.

【Key words】 Thyroid neoplasm； Livin； RNA interference； Invasion； Migration； Animal model

First-authors address：The Peoples Hospital of Binzhou，Binzhou 256610，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2017.14.002

甲狀腺乳頭狀癌的發病率正逐年上升。Livin與腫瘤的發生、惡性侵襲和轉移具有密切相關性[1-2]。筆者前期研究結果已發現Livin在甲狀腺乳頭狀癌組織中呈高表達狀態，并且Livin與腫瘤的臨床分期、淋巴結轉移都明顯有關[3]。磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/AKT）信號轉導通路在腫瘤細胞的侵襲轉移過程之中發揮著重要的作用，3-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶1（PDK1）及第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源的基因（PTEN）是該信號通路的重要基因[4]。新近的研究結果表明，Livin還能夠明顯促進肺癌及口腔鱗癌細胞的增殖、局部侵襲和轉移[5-6]。

本研究通過構建慢病毒載體介導的shRNA沉默甲狀腺乳頭狀癌細胞中Livin基因，觀察Livin對甲狀腺乳頭狀癌TPC-1細胞的生物學行為的影響，構建裸鼠成瘤模型，分析Livin促進甲狀腺乳頭狀癌細胞生長及侵襲轉移的作用機理。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 人甲狀腺乳頭狀癌TPC-1細胞。慢病毒載體攜帶質粒pGCSIL-GFP、Livin-shRNA和構建的陰性對照（scramble）序列等。反轉錄試劑盒、Taq DNA聚合酶、Trizol試劑等。BALB/C雌性裸鼠，4～6周齡，體質量在15～21 g。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 TPC-1細胞株在DMEM細胞培養液中培養，在溫度為37 ℃、5%CO2孵箱中進行培養。

1.2.2 慢病毒Livin-shRNA轉染，構建穩定轉染Livin-shRNA的甲狀腺乳頭狀癌TPC-1細胞選用生長較好的TPC-1細胞按照4×104個/孔的密度接種于6孔板之中，當細胞融合率能達到60%～80%的時候，選用含有沉默Livin效果最好的靶點序列（5-GGAAGAGACTTTGTCCACA-3）及其陰性對照（scramble）序列，制備成穩定感染Livin-shRNA的TPC-1細胞干擾組及陰性對照組；無任何處理的TPC-1細胞設為空白組。

1.2.3 RT-PCR實驗檢測Livin mRNA的表達 在細胞轉染48 h后，分別收集各組的TPC-1細胞，利用Trizol RNA提取腫瘤細胞的總RNA，放置在-80 ℃冰箱暫時保存或者直接進行反轉錄。反轉錄成cDNA，在PCR擴增儀上進行擴增。將目的基因產物與內對照β-actin密度比值計算。

1.2.4 Western印跡實驗檢測轉染之后Livin蛋白表達 在細胞轉染48 h后，分別收集各組TPC-1細胞，然后裂解細胞并提取總蛋白。蛋白上樣、PVDF轉膜，脫脂奶粉封閉，加入兔抗人Livin抗體，內參選用GAPDH，以目標蛋白電泳條帶的灰度值與GAPDH灰度值之比表示相對的表達量。

1.2.5 MTT實驗檢測細胞生長 分別收集處于對數生長期的各組細胞，然后調整細胞懸液的濃度并接種于96孔板之中，每組設定有5個復孔，加入MTT溶液和DMSO，在酶聯免疫檢測儀用490 nm波長測各孔吸光度（A）值，并繪制腫瘤細胞生長曲線。

1.2.6 流式細胞術檢測轉染后TPC-1細胞周期變化 收集轉染48 h后的TPC-1細胞，離心后75%乙醇固定，重懸細胞再加入PI染色劑和RNase A，流式細胞儀檢測細胞周期變化。

1.2.7 流式細胞儀檢測細胞凋亡 收集轉染48 h 的TPC-1細胞，制成單細胞懸液。置入5 mL流式管中，分別加入AnnexinⅤ/FITC和碘化丙錠，混合均勻。用流式細胞儀檢測，結果用隨機軟件進行分析。

1.2.8 Transwell小室實驗檢測各組細胞的侵襲能力 應用Transwell小室侵襲模型，無血清細胞培養基使Matrigel稀釋成2倍，然后加入Transwell上室，將細胞密度調整至4×105個/mL，在6孔板下室中加入無血清DMEM培養基，在上室內加入單細胞懸液，固定后并染色，計算出每個視野的平均值。

1.2.9 Western印跡檢測各組細胞AKT、p-AKT、PDK1及PTEN蛋白表達 分別收集沉默48 h后的各組細胞，提取腫瘤細胞的總蛋白，實驗的步驟同前，分別孵育一抗（AKT、p-AKT、PDK1和PTEN），洗膜后孵育二抗等。計算時以目的基因的蛋白凝膠電泳條帶灰度值與對應的GAPDH灰度值之比來表示相對的表達量。

1.3 建立裸鼠甲狀腺乳頭狀癌模型 取BALB/c雌性裸小鼠30只，隨機分成空白組、陰性對照組和干擾組（各10只），制成細胞懸液，接種于裸鼠的頸背皮下處。在種植后的第1、7、14、21、28天分別測量腫瘤的最長徑a和最短徑b，根據公式來計算腫瘤的體積V，計算公式V（mm3）=πab2/6。然后繪制出裸鼠的瘤體體積-時間曲線，在第28天處死所有的裸鼠，最后測量種植瘤的質量。

1.4 統計學處理 采用SPSS 13.0軟件對所得數據進行統計分析，計量資料用（x±s）表示，計數資料以率（%）表示，比較采用 字2檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 靶向shRNA能夠明顯降低TPC-1細胞中Livin mRNA的表達 RT-PCR的結果表明：干擾組、陰性對照組及空白組的Livin mRNA相對表達量分別為（0.15±0.04）、（0.72±0.11）和（0.76±0.13）；干擾組中的Livin mRNA的表達量均明顯低于陰性對照組和空白組（P<0.05），Livin mRNA的表達量在陰性對照組和空白組之中無明顯差異，見圖1。