人表皮干細胞體外誘導分化為汗腺樣上皮細胞的研究*

王元元，楊桂紅，楊 濤，唐書謙，伍津津△

(第三軍醫大學大坪醫院野戰外科研究所：1.整形美容科；2.皮膚科，重慶 400042)

·論 著·

人表皮干細胞體外誘導分化為汗腺樣上皮細胞的研究*

王元元1，楊桂紅2，楊 濤2，唐書謙2，伍津津2△

(第三軍醫大學大坪醫院野戰外科研究所：1.整形美容科；2.皮膚科，重慶 400042)

目的 探討體外人表皮干細胞向汗腺樣上皮分化的影響條件，并對誘導成的管腔樣結構進行鑒定。方法 將人表皮干細胞接種到復方殼多糖真皮基質上和膠原凝膠中，加入不同濃度的表皮生長因子(EGF)，體外垂直震蕩培養，進行三維培養和定向誘導分化，采用HE染色、免疫熒光等手段觀察表皮干細胞定向分化為汗腺樣上皮的條件及形態、表型改變。結果 15～20 ng/mL的EGF可誘導組織工程真皮上的表皮干細胞向真皮內生長并可出現腺樣結構。HE 染色該結構，顯示為單層細胞連接為環狀，中間見明顯的腔隙，細胞質嗜酸性。利用CK19熒光染色，在激光共聚焦顯微鏡下觀察到細胞團中央有管腔結構，同時此結構表達CK18、癌胚抗原(CEA)。結論 體外培養的人表皮干細胞接種在組織工程真皮上，在一定濃度的EGF誘導條件下，能形成管腔樣結構，該管腔樣結構在形態學、組織學上與在體汗腺分泌部細胞相似。

表皮干細胞；汗腺樣細胞；分化；表皮生長因子

臨床上由于各種原因，如皮膚全層大面積燒傷、缺損和其他伴有汗腺發育和功能異常的疾病(如先天性外胚層發育不良等)，導致的汗腺結構和功能缺失，排汗及體溫調節能力受限，嚴重影響了患者的生活質量。盡管近年來組織工程化皮膚用于臨床治療，可以解決創面覆蓋的問題，已取得了顯著效果，但迄今為止，還未研制出帶有皮膚附件(如汗腺、毛囊等) 的組織工程化皮膚，無法達到皮膚功能的重建[1]。表皮干細胞(ESC)是皮膚組織特異性干細胞，位于表皮基底層，在維持表皮更新，保持細胞恒定等方面起著重要作用。ESC具有多向分化潛能，體內證實能夠向皮膚附屬器及表皮分化。若能在體外誘導ESC向汗腺分化，將為研究帶汗腺的組織工程皮膚提供重要實驗依據。本院自行研制的復方殼多糖組織工程真皮基質凝膠是一種組織工程培養模型。利用此三維培養模型，本實驗擬加入影響細胞生長和分化的因素，如表皮生長因子(EGF)等，以促進凝膠中的ESC向汗腺樣上皮分化。進而尋找出ESC向汗腺樣上皮分化的合適培養條件，并對出現的管腔樣結構進行形態鑒定。

1 資料與方法

1.1 一般資料 包皮標本取材于2009年5月至2010年4月在本院皮膚科醫學美容門診行包皮環切術的青年男性20例，平均年齡(23.56±2.43)歲，所有取材均取得患者同意并簽署知情同意書，本研究通過本院倫理委員會審查(批號為20080312)。

1.2 主要試劑及儀器 K-SFM培養基，Ⅳ型膠原(美國Sigma公司)，中性分離酶(瑞士Roche公司)，胰蛋白酶(美國Hyclone公司)，胎牛血清(FBS)，杜爾伯科改良伊格爾培養基DMEM(美國Gibco公司)，EGF(美國Sigma公司)，殼多糖，兔抗人CEA抗體，鼠抗人CK18、19抗體，羊抗鼠IgG-FITC抗體(北京中杉公司)，激光共聚焦顯微鏡(德國Leica公司)。

1.3 方法

1.3.1 鼠尾膠原的制備 凍存300 g左右大白鼠鼠尾3根，于75%乙醇溶液中解凍1 h；去皮，D-Hanks液沖洗3遍，抽出尾腱，剪碎成泥，溶于無菌的1%冰醋酸250 mL中，4 ℃保存48 h以上，其間反復振蕩；3 000 r/min離心1 h，取上清液；所得物位乳白色半透明黏稠液體，4 ℃貯存備用，測得濃度為20 mg/mL(濕質量)。

1.3.2 復方殼多糖組織工程皮膚的制備及誘導條件的優化 應用酶消化法進行人成纖維細胞的培養，按照文獻所述方法獲得人表皮干細胞[2]。在冰浴條件下按比例混勻醋酸鼠尾膠原、殼多糖、硫酸軟骨素、透明質酸、彈性蛋白及濃縮DMEM；用1N 氫氧化鈉調節pH值至7.2～7.4；在凝膠中加入成纖維細胞，細胞量達到105/mL；吸入24孔板培養板中，每孔1 mL，放入孵箱內待形成凝膠后，每孔輕輕加入1代表皮干細胞1 mL(濃度為8×105/mL)于凝膠上，最后再加入角質化細胞生長培養基(KGM)，置37 ℃、5%CO2/95%空氣、90%以上濕度孵箱培養，每天換液1次；培養3 d后，用不銹鋼篩網支架抬高3 mm，行氣液界面培養，每日垂直振蕩，振蕩頻率為75次/分，振幅為2 cm；隔日添加下列因素：EGF 5、10、15、20 ng/mL，每組按3復孔進行實驗；培養16 d后，用4%多聚甲醛固定后行HE染色，觀察皮膚生長情況，選取合適的濃度。

1.3.3 復方殼多糖組織工程凝膠的制備及鑒定 在冰浴條件下按比例混勻醋酸鼠尾膠原、殼多糖、硫酸軟骨素、透明質酸、彈性蛋白及濃縮DMEM；用1N 氫氧化鈉調節pH值至7.2～7.4；在凝膠中加入1代表皮干細胞，細胞量同前；吸入24孔板培養板中，每孔1 mL，放入孵箱內待形成凝膠后，再加入KGM，置37 ℃、5%CO2/95%空氣、90%以上濕度孵箱培養，每天換液1次；每日垂直振蕩，振蕩頻率為75次/分，振幅為2 cm；加入上述定向誘導分化條件篩選出的合適濃度。對復方殼多糖組織工程凝膠進行如下鑒定：(1)按常規進行 HE 染色；(2)免疫熒光觀察：將凝膠置于4%多聚甲醛中固定2 h，磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗5 min×3次；加一抗工作液[CK19、CK18、癌胚抗原(CEA)]，濕盒內 37℃孵箱內放置30 min，PBS漂洗5 min×3次；加入熒光標記的抗體羊抗鼠 IgG-FITC 1∶100，濕盒內 37 ℃孵箱內放置30 min，PBS漂洗5 min×3次；緩沖甘油封片；將制備的樣品放在激光掃描共聚焦顯微鏡的載物臺上，在倒置顯微鏡下尋找細胞后轉到激光光源進行掃描；(3)透射電鏡掃描觀察。

2 結 果

2.1 組織工程皮膚定向誘導分化的條件 各組EGF作用于組織工程皮膚時，均可見皮膚熟化程度較高，表皮分化良好，表真皮結合較好，但5 ng/mL EGF未見明顯的表皮細胞向凝膠內生長；10 ng/mL EGF時表皮細胞向凝膠內生長，但未見明顯的管腺樣結構。15 ng/mL及20 ng/mL EGF作用于組織工程皮膚時，可見表皮細胞向真皮基質凝膠內生長，并出現管腺樣結構，見圖1。

A：EGF 5 ng/mL；B：EGF 10 ng/mL；C：EGF 15 ng/mL；D：EGF 20 ng/mL。

圖1 不同濃度的EGF作用于組織工程皮膚(×200)

2.2 管腔樣結構的鑒定

2.2.1 組織學觀察 組織切片 HE 染色可見凝膠內的細胞成團生長形成管腔樣結構，管腔結構的管壁由單層細胞構成，中間可見較大腔隙，細胞質紅染，部分細胞核位于基底部，顏色較深，部分細胞形態可見腔面窄、基底部大，排列有一定的極性，與汗腺分泌部管狀結構相似，見圖2。

A：×100；B：×400。

圖2 60 μm冰凍切片HE染色

A：抗-CK18陽性；B：抗-CK18陽性；C：抗CEA抗體陽性。

圖3 CLSM掃描下免疫熒光觀察

2.2.2 免疫熒光觀察 ESC和汗腺細胞均表達的CK19，在CLSM掃描下，利用抗-CK19抗體觀察凝膠中細胞的形態。發現有細胞聚集成團，形成管腔樣結構，管腔結構由單層細胞構成的管壁和中央空腔組成，與汗腺分泌部的管狀結構相似(圖3A)。管腔樣結構抗-CK18(圖3B) 和抗-CEA (圖3C)免疫熒光染色均表達陽性。

3 討 論

汗腺是皮膚重要的附屬器之一，汗腺發育起始于胚胎的第11周左右， 31周左右便停止發育[3]。ESC是汗腺發育的基礎，成人時大部分定位于毛囊隆突部。有學者提出的隆突激活假說認為，當干細胞所處的微環境發生改變時，細胞外的某些信息便可以通過整合素等傳遞給干細胞，以觸發其跨膜信號轉導，激活干細胞的分化多潛能性[4]。所以ESC存在向毛囊上皮細胞、皮脂腺細胞、表皮基底細胞、汗腺腺上皮細胞分化的4條可能途徑。更多的實驗也證明了隆突激活假說的正確性[5-9]。

ESC的增殖與分化受到干細胞“壁龕(Niche)”的調控。干細胞“壁龕”即干細胞所處的微環境，通過細胞與細胞、細胞與細胞外基質兩種方式調控著干細胞的增殖與分化。本研究認為，EGF是ESC維持自我更新和分化的基礎，不同濃度的EGF可能導致干細胞不同的轉歸。一方面，低濃度的EGF在體外維持干細胞未分化狀態中起著重要作用，是培養ESC必不可少的培養基添加物。目前常用的表皮干細胞培養基如KSFM、Epilife中EGF的濃度為5 ng/mL。另一方面，EGF亦能促使干細胞的分化。有研究表明，表皮細胞不僅能表達EGF，同時也能表達其受體，呈自分泌作用，在表皮的組織學結構中，從表皮基底層到棘細胞層細胞均包含有表皮細胞生長因子受體[10]，且EGF受體在表皮成層期方能檢出，并隨胚齡延展而表達增多，這樣就為采用EGF誘控干細胞分化提供了理論依據。從組織發育學的角度講，表皮及皮膚附屬器同源(外胚層) ，即皮膚附屬器由表皮增生并分化而成?？梢哉J為汗腺的發生，實質上是在胚胎發生期由某種或多種因素誘導表皮干細胞定向分化為汗腺細胞的過程，表皮干細胞充當著不斷完善汗腺組織的角色[11]。Shikiji 等[12]將含表皮干細胞的人角質形成細胞，接種于成纖維細胞與膠原材料的復合物中，進行三維培養，發現高濃度EGF(大于15 ng/mL)能夠誘導人工真皮內出現汗腺導管樣結構。鄧辰亮等[13]用高濃度的EGF(50 ng/mL、100 ng/mL)對二維培養的人表皮細胞進行誘導分化，發現人表皮干細胞增殖能力明顯，并表達汗腺相對特異性的標志NHE-1及NKCC-1。

在本研究中，利用EGF誘導組織工程皮膚上的1代表皮干細胞，可見表皮細胞向真皮基質凝膠內生長，出現的管腔樣結構由一至兩層細胞構成，中央有腔隙。將膠原凝膠中誘導的管腔樣結構利用冰凍切片 HE 染色后觀察，該結構由單層細胞構成，胞核較大，偏向基底部，胞漿嗜酸性。細胞間的結合不緊密，沒有明顯的基底膜及肌上皮細胞，但與正常外泌汗腺分泌細胞HE染色有相似性。 免疫熒光利用ESC與腺上皮細胞共表達的細胞表面分子標記CK19來染色凝膠中的細胞，發現細胞均有染色，其中可見細胞聚集成團形成管腔樣，同時構成管腔樣結構的細胞CK18 和 CEA染色均為陽性表達。綜合HE染色、免疫熒光及透射電鏡結果分析，本研究認為，所誘導的管腔樣結構中的細胞與汗腺腺上皮分泌部細胞從形態學上有一定的相似性。

目前有大量證據表明了EGF在汗腺的發生及維持上的重要作用。Aybay等[14]報道了EGF在頂漿汗腺液中及外分泌汗腺液中的存在。Saga等[15]證實EGF分布在汗腺分泌部，發現在人發育及成熟的汗腺中高度表達EGF活性受體。研究者證實在外分泌汗腺的真皮導管中，EGF受體呈高水平表達[16]。產后應用EGF治療X性連鎖無汗性外胚葉發育不良(XLHED)tabby鼠時，誘導出鼠爪部功能性汗腺的形成。反之，降低tabby鼠中EGFR的表達，則EGF誘導的上述功能性汗腺無法形成[17]。

從本研究的結果來看，低濃度的EGF(5～10 ng/mL)能夠使真皮凝膠上的表皮細胞分層良好，但未能促進細胞向凝膠內生長；較高濃度的EGF(15～20 ng/mL)可以促進表皮細胞向真皮基質凝膠內生長，并出現管腔樣結構。該結果與有關研究有一致性[12]。但EGF是如何誘導干細胞出現分化并形成管腔樣結構，具體機制仍然需要下一步的研究。

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Research on human epidermal stem cells differentiating into glandular epithelium-like cells in vitro*

WangYuanyuan1，YangGuihong2,YangTao2，TangShuqian2,WuJinjin2△

(1.DepartmentofPlasticandCosmeticSurgery;2.DepartmentofDermatology,DapingHospital,InstituteofFieldSurgeryResearch,ThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing400042,China)

Objective To investigate the influencing conditions of human epidermal stem cells(ESCs) differentiating into gland-like cells and to identify the induced tubular structure.Methods The ESCs were seeded onto compound polysaccharide shell dermal matrix and collagen gel,adding different concentrations of epidermal growth factor(EGF) and culturing by vertical shaking in vitro,the three dimensional culture and induced directional differentiation were performed.The means of HE staining,immunofluorescence and confocal laser scanning microscope were adopted to observe the conditions,morphology and phenotype change of ESCs directionally differentiating into glandular epithelium-like cells.Results 15-20 ng/mL EGF could induce ESCs in tissue-engineering dermis to grow into dermis and appear the gland-like structure.The HE staining in this structure showed its profile as a single layer with lacune in the middle compartment,eosinophilic cytoplasm,lightly stained.Under CLSM,by CK19 staining,the luminal structure in the middle of the cell mass was observed,while CK18 and CEA were expressed in this structure.Conclusion Under the induction of particular concentration of EGF,the in vitro cultured human ESCs seeded on the tissues engineering dermis could form into the tubular structure,which is similar to the in vivo sweat gland secretory cells in morphology and histology.

epidermal stem cell;glandular epithelium-like cell;differentiation;epidermal growth factor

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.10.001

國家自然科學基金資助項目(81201244)。 作者簡介：王元元(1981-)，主治醫師，博士，主要從事表皮干細胞的研究。△

,E-mail：wjjjj@163.com。

R339.3+7

A

1671-8348(2017)10-1297-03

2016-10-18

2017-01-21)