三種蛋白酶酶解核桃餅粕的抗氧化活性研究

羅燕，和興萍，李雪，趙聲蘭*

（云南中醫學院中藥學院，云南昆明650500）

三種蛋白酶酶解核桃餅粕的抗氧化活性研究

羅燕，和興萍，李雪，趙聲蘭*

（云南中醫學院中藥學院，云南昆明650500）

該研究以核桃餅粕（WC）、石油醚脫脂核桃餅粕（PEWC）、石油醚及丙酮脫脂核桃餅粕（PEAWC）、核桃餅粕分離蛋白（WCP）、石油醚脫脂核桃餅粕分離蛋白（PEWCP）、石油醚及丙酮脫脂核桃餅粕分離蛋白（PEAWCP）為研究對象，分別采用堿性蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶超聲水解，以抗氧化活性為評價指標，篩選最佳的蛋白酶及原料處理方法。結果表明，堿性蛋白酶水解PEWC對OH·、O2-·和DPPH·清除率最高，分別為18.74%、28.44%和79.96%；胰蛋白酶酶解PEWC的總還原力最大；胰蛋白酶水解PEWCP的OH·和DPPH·清除率最高，分別為21.44%和80.22%，但O2-·清除率較低；胃蛋白酶水解PEWCP的O2-·清除率最高，達30.23%；堿性蛋白酶酶解PEWCP的總還原力最大；核桃餅粕經石油醚脫脂后的酶解產物抗氧化活性最高，且以堿性蛋白酶為最佳水解酶。

核桃餅粕；核桃餅粕分離蛋白；蛋白酶；自由基清除率；抗氧化活性

LUO Yan,HE Xingping,LI Xue,ZHAO Shenglan*
(Faculty of Traditional Chinese Medicine,Yunnan University of Traditional Chinese Medicine,Kunming 650500,China)

核桃（Juglans reginLinn.）又名胡桃、羌桃，屬胡桃科核桃屬植物，是一種重要的木本油料作物，營養價值高[1]。冷榨核桃餅粕為核桃冷榨取油后的副產物[2]，蛋白質含量豐富，脫脂核桃餅粕中蛋白質含量高達53.89%[3]，含有包括8種人體必需氨基酸在內的18種氨基酸，是一種優質植物蛋白[4]。核桃餅粕蛋白分子結構復雜，相對分子質量較大，不利于生物體的消化和吸收[5-6]。酶解蛋白質是改善蛋白質特性的一種有效方法，核桃蛋白經酶解后利于消化和吸收，營養價值提高，且酶解生成具有保護神經、抑制血管緊張素轉化酶及改善學習記憶等多種生物功能的活性肽[7-9]。

目前對核桃餅粕酶解的研究較少，核桃餅粕大多用于飼料，利用價值較低。對核桃蛋白的研究較多，核桃蛋白酶解產物抗氧化活性的研究主要集中在優化酶解條件[10-11]，通過酶解提高核桃蛋白的溶解性和抗氧化特性[12]。在酶解過程中，底物和酶的選擇對于酶解物抗氧化活性的高低至關重要[13]。植物蛋白酶如木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶等酶解效率相對較低，且容易失活[14-15]；胃蛋白酶、胰蛋白酶和微生物來源的堿性蛋白酶均為內切酶，對核桃蛋白的酶解效果較好，可快速消化核桃蛋白質[16]。蛋白多肽的抗氧化活性受很多因素影響，且作用機制多樣，單一檢測體系往往很難全面反映其抗氧化能力，需采用多種體系來研究其作用效果[17-18]。本研究分別采用堿性蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶酶解經不同處理方式處理的核桃餅粕，測定酶解物的羥自由基、超氧陰離子自由基、DPPH自由基清除率和總還原力，分析不同種類蛋白酶對不同處理的核桃餅粕酶解物抗氧化活性的影響，篩選出最佳蛋白酶及原料處理方式，以期為利用核桃餅粕制備抗氧化活性肽和高效綜合開發利用核桃餅粕奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

核桃餅粕：云南匯智源食品有限公司；堿性蛋白酶（酶活2×105U/g）：寶生物工程TaKaRa（大連）有限公司；胃蛋白酶（酶活為3 000 U/g）、胰蛋白酶（酶活為2.5×104U/g）：昆明鼎國生物技術有限公司；濃鹽酸、氫氧化鈉、硫酸亞鐵、過氧化氫、水楊酸、焦性沒食子酸、乙二胺四乙酸二鈉（ethylene diamine tetraacetic acid-2Na，EDTA-2Na）、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉（均為分析純）：天津市風船化學試劑科技有限公司；抗壞血酸（分析純）：重慶創導化工有限公司；三羥基氨基甲烷（分析純）：上海埃博商貿有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）：上海如吉生物科技發展有限公司；三氯乙酸（分析純）：天津市大茂化學試劑廠；無水三氯化鐵（分析純）：上海泰坦科技股份有限公司；鐵氰化鉀（分析純）：西安化學試劑廠。1.2儀器與設備

CH1015T超級恒溫槽：上海精密儀器有限公司；L550/530離心機：長沙高新技術開發區湘儀離心機儀器有限公司；YH-A 30002電子天平：瑞安市英衡電器有限公司；CP214電子天平：奧豪斯儀器（上海）有限公司；UV mini 1240紫外可見分光光度計：日本島津公司；SK7210HP超聲波清洗器：上海科導超聲儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 核桃餅粕及脫脂核桃餅粕的制備

核桃餅粕（walnut cake，WC）：將冷壓榨制備核桃油后的核桃餅粕粉碎，過80目篩。

石油醚脫脂核桃餅粕（petroleum ether defatted walnut cake，PEWC）：以核桃餅粕為原料，石油醚（沸程60～90℃）為溶劑，料液比1∶10（g∶mL），50℃超聲回流提取40 min，脫脂，靜置15 min，分離并回收上層石油醚，下層核桃餅粕用石油醚再次脫脂后干燥，得PEWC。

石油醚及丙酮脫脂核桃餅粕（petroleumetherandacetone defatted walnut cake，PEAWC）[19]：以石油醚脫脂核桃餅粕為原料，丙酮為溶劑，料液比1∶12（g∶mL），50℃超聲回流提取30 min，靜置15 min，分離并回收上層丙酮，下層核桃餅粕干燥，得PEAWC。

1.3.2 核桃餅粕分離蛋白的制備[20]

分別稱取100 g WC、PEWC、PEAWC于2 000 mL燒杯，加蒸餾水2 000 mL，攪拌混勻，用1 mol/L NaOH調節pH至9.0，混勻，50℃超聲提取（超聲功率250W）1 h，靜置30 min，3000r/min離心20min，上清液用1mol/L鹽酸調節pH至4.5，攪拌，靜置30 min，3 000 r/min離心20 min，沉淀層加蒸餾水洗至中性，3 000 r/min離心20 min，冷凍干燥，得核桃餅粕分離蛋白（walnut cake protein，WCP）、石油醚脫脂核桃餅粕分離蛋白（petroleum ether defatted walnut cake protein，PEWCP）、石油醚及丙酮脫脂核桃餅粕分離蛋白（petroleum ether and acetone defatted walnut cake protein，PEAWCP）。

1.3.3 蛋白質含量的測定

按照GB/T5009.5—2016《食品安全國家標準食品中蛋白質的測定》中的分光光度法測定核桃餅粕蛋白含量，以氨氮標準溶液（0.1 g/L）制作標準曲線，以蛋白質含量（x）為橫坐標，吸光度值（y）為縱坐標，繪制標準曲線，得回歸方程y=0.006 2x-0.003 5，相關系數R2=0.998 8。根據標準曲線回歸方程計算各樣品的蛋白質含量。

1.3.4 核桃餅粕及核桃餅粕分離蛋白酶解物的制備[21]

選擇堿性蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶進行水解，各蛋白酶的反應條件見表1。分別配制5%WC、PEWC、PEAWC、WCP、PEWCP、PEAWCP溶液，充分攪拌，90℃水浴15 min，調pH到蛋白酶的最適范圍，加入適量蛋白酶，在各蛋白酶適宜條件下酶解2 h。酶解過程中，通過滴加1 mol/L NaOH溶液或1mol/L鹽酸溶液保持各反應液的pH值。反應結束后，酶解液于100℃水浴滅酶15 min，冷卻，調節pH值至7.0，4000r/min離心5min，上清液經冷凍干燥后即為酶解產物。

表1 各蛋白酶的最適反應條件Table 1 Optimum reaction conditions of protease

1.3.5 核桃餅粕及核桃餅粕分離蛋白酶解物體外抗氧化活性測定

（1）羥基自由基（OH·）清除率的測定[22]

在10mL試管中依次加入2mL9mmol/L硫酸亞鐵溶液、2mL9mmol/L乙醇-水楊酸溶液，然后分別加入2mL1mg/mL的WC、PEWC、PEAWC、WCP、PEWCP、PEAWCP樣品酶解液和2 mL 8.8 mmol/L H2O2，混勻，37℃水浴30 min，以蒸餾水調零，在波長510 nm處測定吸光度值A1；以2 mL蒸餾水代替H2O2，測定其吸光度值A2；以2 mL蒸餾水代替樣品酶解液，測定其吸光度值A0。OH·清除率計算公式如下：

（2）超氧陰離子自由基（O2-·）清除率的測定[22]

分別取4.5 mL 50 mmol/L Tris-HCl緩沖液（25℃，pH 8.2）于18支10 mL試管中，分別加入1 mL 1 mg/mL的WC、PEWC、PEAWC、WCP、PEWCP、PEAWCP樣品酶解液，0.4 mL 50 mmol/L鄰苯三酚，混勻，反應3 min后，立即加入100 μL 3%抗壞血酸終止反應，迅速取1 mL至試管中，加4 mL蒸餾水混勻，以蒸餾水調零，于波長325 nm處測定吸光度A1；用0.4 mL蒸餾水代替鄰苯三酚，測定吸光度值A2；用1 mL蒸餾水代替樣品酶解液，測得吸光度值A0。O2-·清除率計算公式如下：

（3）DPPH自由基清除能力的測定[22]

分別取2 mL 1 mg/mL的WC、PEWC、PEAWC、WCP、PEWCP、PEAWCP樣品酶解液于18支10mL試管中，分別加入2 mL 0.1 mmol/L的DPPH，混勻，室溫暗處放置30 min，以無水乙醇調零，于波長517nm處測定吸光度值A1；用2 mL無水乙醇代替DPPH，測定吸光度值A2；用2 mL無水乙醇代替樣品酶解液，測定吸光度值A0。DPPH·清除率計算公式如下：

（4）總還原力的測定[16]

分別取2 mL 1 mg/mL的WC、PEWC、PEAWC、WCP、PEWCP、PEAWCP樣品酶解液于18支10 mL試管，分別加入2 mL 0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 6.6），混勻，2 mL 1%鐵氰化鉀，混勻，50℃水浴保溫20 min，迅速冷卻至室溫，向混合物中加入2mL10%三氯乙酸終止反應，3 000 r/min離心10 min。取上清液2 mL，加2 mL蒸餾水及0.4 mL 0.1%三氯化鐵溶液，混勻，室溫放置10 min，以蒸餾水調零，于波長700 nm處測定吸光度值A，其吸光度值越大，表明還原能力越強。

2 結果與分析

2.1 核桃餅粕中蛋白含量

核桃餅粕及經不同方式處理的核桃餅粕各樣品中蛋白質含量檢測結果見表2。由表2可知，各核桃餅粕原料的蛋白質含量從大到小分別為PEWC＞PEAWC＞WC，PEWCP＞PEAWCP＞WCP，結果表明，石油醚脫脂處理后的核桃餅粕及核桃餅粕分離蛋白的蛋白質含量均大于其余兩種處理方式。這可能是由于未脫脂的核桃餅粕及核桃餅粕分離蛋白中含有較多油脂，經過石油醚及丙酮二次脫脂后破壞了部分蛋白質，故蛋白質含量降低。

表2 各核桃餅粕原料的蛋白質含量Table 2 Protein contents of the different walnut cake raw materials

2.2 酶解產物體外抗氧化活性的測定

2.2.1 酶解產物的羥基自由基（OH·）清除率

圖1WC、PEWC、PEAWC、WCP、PEWCP、PEAWCP的酶解產物對OH·的清除能力Fig.1 Scavenging activity of enzymolysis products of WC,PEWC, PEAWC,WCP,PEWCP,and PEAWCP on OH·

由圖1可知，堿性蛋白酶酶解時，對OH·清除能力從強到弱分別為PEWC＞WC＞PEAWC，PEWCP＞PEAWCP＞WCP，PEWC和PEWCP酶解液對OH·清除作用較強，PEWC和PEWCP對OH·清除率分別為18.74%、18.09%，直接進行酶解的樣品與經過堿溶酸沉提取蛋白再酶解的樣品對OH·的清除作用差異不顯著；胃蛋白酶酶解樣品時，對OH·清除能力從強到弱分別為PEWC＞WC＞PEAWC，WCP＞PEWCP＞PEAWCP，經過堿溶酸沉提取蛋白再酶解的樣品對OH·的清除作用明顯強于直接進行酶解的樣品；胰蛋白酶酶解樣品時，對OH·的清除能力從強到弱分別為PEAWC＞PEWC＞WC，PEWCP＞PEAWCP＞WCP，其中PEWCP對OH·清除率最高，達21.44%，且經過堿溶酸沉提取蛋白再酶解的樣品對OH·的清除作用明顯強于直接進行酶解的樣品。

堿性蛋白酶酶解物OH·清除率高的主要原因是堿性蛋白酶酶解蛋白可產生大量的疏水性氨基酸，疏水性氨基酸易于與自由基結合從而產生良好的OH·清除能力[14，23]，胰蛋白酶酶解物的OH·清除率高的主要原因是胰蛋白酶酶解蛋白可產生大量的精氨酸、賴氨酸等堿性氨基酸的肽鍵[15]，此外，胰蛋白酶分解核桃蛋白的速率高于胃蛋白酶，使胰蛋白酶能快速水解已溶于水的蛋白，加快酶與自由基的結合從而產生良好的OH·清除能力[24]。

直接酶解的WC、PEWC、PEAWC酶解液中，堿性蛋白酶水解PEWC的OH·清除率最高，達18.74%；經堿溶酸沉提取蛋白再酶解的WCP、PEWCP、PEAWCP酶解液中，胰蛋白酶水解PEWCP的OH·清除率最高，達21.44%。PEWC經堿性蛋白酶、胃蛋白酶酶解后對OH·的清除作用強于WC和PEAWC，PEWCP經堿性蛋白酶、胰蛋白酶酶解后對OH·的清除作用強于WCP和PEAWCP，其原因可能是WC、WCP未經石油醚脫脂，其中含有較多的脂肪和碳水化合物等雜質，對蛋白酶解反應影響，使OH·的清除率降低，PEAWC、PEAWCP由于先后使用石油醚和丙酮脫脂，兩者均為有機溶劑，丙酮二次脫脂可能造成部分核桃餅粕蛋白變性和破壞，導致OH·的清除率降低[25]。

從清除OH·角度出發，堿性蛋白酶酶解PEWC和胰蛋白酶酶解PEWCP的清除作用較強。

2.2.2 酶解產物的超氧陰離子自由基（O2-·）清除率

圖2WC、PEWC、PEAWC、WCP、PEWCP、PEAWCP的酶解產物對O2-·的清除能力Fig.2 Scavenging activity of enzymolysis products of WC,PEWC, PEAWC,WCP,PEWCP,and PEAWCP on O2-·

由圖2可知，堿性蛋白酶、胃蛋白酶和胰蛋白酶酶解WC、PEWC、PEAWC、WCP、PEWCP、PEAWCP得到的酶解液對O2-·的清除作用均呈現相似的規律，其清除O2-·的能力從強到弱分別為PEWC＞WC＞PEAWC，PEWCP＞WCP＞PEAWCP，經石油醚脫脂處理的核桃餅粕及核桃餅粕分離蛋白的酶解液對O2-·清除作用均分別強于其他兩種處理。

直接酶解的WC、PEWC、PEAWC酶解液中，堿性蛋白酶水解PEWC的O2-·清除率最高，達28.44%；經堿溶酸沉提取蛋白再酶解的WCP、PEWCP、PEAWCP酶解液中，胃蛋白酶水解PEWCP的O2-·清除率最高，達30.23%，其次是堿性蛋白酶水解PEWCP，達29.65%。堿性蛋白酶酶解PEWC和胃蛋白酶酶解PEWCP有良好的OH·清除作用。

經堿溶酸沉提取蛋白再酶解的胃蛋白酶酶解液和胰蛋白酶酶解液對O2-·的清除作用顯著強于直接進行酶解的樣品，其原因可能是核桃餅粕經過堿溶酸沉提取蛋白后雜質減少，利于酶解反應，從而增強對O2-·的清除作用[26]。

從清除O2-·角度出發，堿性蛋白酶酶解PEWC和胃蛋白酶酶解PEWCP的清除作用較強。

2.2.3 酶解產物的DPPH·清除率

由圖3可知，經石油醚脫脂再酶解對DPPH·清除率較高，但經石油醚和丙酮二種溶劑脫脂再酶解對DPPH·清除率最低，其原因可能是PEAWC、PEAWCP由于先后使用石油醚和丙酮脫脂，造成部分蛋白質的變性或破壞，導致酶解液對DPPH·的清除率降低[25]。經堿溶酸沉提取蛋白再用胃蛋白酶和胰蛋白酶酶解WCP、PEWCP、PEAWCP的DPPH·清除率均大于直接酶解的WC、PEWC、PEAWC樣品，其原因可能是核桃餅粕經過堿溶酸沉提取蛋白后雜質減少，利于酶解反應、利于抑制反應體系中產物的生成，從而增強對DPPH·的清除作用。

圖3WC、PEWC、PEAWC、WCP、PEWCP、PEAWCP的酶解物對DPPH·的清除能力Fig.3 Scavenging activity of enzymolysis products of WC,PEWC,PEAWC,WCP,PEWCP,and PEAWCP on DPPH·

直接酶解的WC、PEWC、PEAWC酶解液中，堿性蛋白酶水解PEWC的DPPH·清除率達79.96%，顯著高于其他處理樣品；經堿溶酸沉提取蛋白再酶解的WCP、PEWCP、PEAWCP酶解液中，胰蛋白酶酶解液對DPPH·的清除率均大于堿性蛋白酶酶解液和胃蛋白酶酶解液，其中胰蛋白酶水解PEWCP的DPPH·清除率達80.22%，顯著高于其他處理樣品。

從清除DPPH·角度出發，堿性蛋白酶酶解PEWC和胰蛋白酶酶解PEWCP的清除作用較強。

2.2.4 酶解產物總還原力的的測定

圖4WC、PEWC、PEAWC、WCP、PEWCP、PEAWCP酶解物的總還原力Fig.4 Total reducing power of enzymolysis products of WC,PEWC, PEAWC,WCP,PEWCP,and PEAWCP

由圖4可知，堿性蛋白酶、胰蛋白酶酶解WC、PEWC、PEAWC、WCP、PEWCP、PEAWCP的總還原力顯著高于胃蛋白酶酶解的對應樣品，當直接酶解WC、PEWC、PEAWC時，胰蛋白酶水解PEWC的還原力最大，吸光度值為0.710；經堿溶酸沉提取蛋白再酶解WCP、PEWCP、PEAWCP時，堿性蛋白酶水解PEWCP的總還原力最大，吸光度值為0.762。與胃蛋白酶酶解液相比，堿性蛋白酶和胰蛋白酶酶解液含有更多的抗氧化劑，給出電子的能力較強。

采用堿性蛋白酶酶解時，總還原力從強到弱分別為WC＞PEAWC＞PEWC，PEWCP＞WCP＞PEAWCP；采用胃蛋白酶酶時，總還原力從強到弱分別為PEAWC＞WC＞PEWC，PEWCP＞WCP＞PEAWCP，胰蛋白酶酶解液的總還原能力相差不大。

從還原能力的角度出發，胰蛋白酶酶解PEWC和堿性蛋白酶酶解PEWCP還原能力較強。

3 結論

堿性蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶直接酶解WC、PEWC、PEAWC的酶解液中，堿性蛋白酶酶解PEWC的OH·、O2-·和DPPH·清除率最高，分別為18.74%、28.44%和79.96%；胰蛋白酶酶解PEWC的總還原力最大；經堿溶酸沉提取蛋白再酶解的WCP、PEWCP、PEAWCP酶解液，胰蛋白酶酶解PEWCP的OH·清除率和DPPH·清除率最高，分別為21.44%和80.22%，胃蛋白酶酶解PEWCP的O2-·清除率最高，達30.23%，堿性蛋白酶酶解PEWCP的總還原力最大。

石油醚脫脂為核桃餅粕原料最佳的處理方式。經堿溶酸沉先提取核桃餅粕中的蛋白質，獲得核桃餅粕分離蛋白后，酶解液的抗氧化活性略高于直接酶解核桃餅粕的酶解液，但考慮原料處理成本，可選擇用石油醚脫出核桃餅粕的油脂后直接酶解，且堿性蛋白酶酶解液的抗氧化活性高。鑒于核桃餅粕蛋白消化酶解產物具有較高的抗氧化活性，有望在與抗氧化相關的抗衰老和改善老年癡呆方面發揮重要作用。

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TS229

0254-5071（2017）05-0170-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.05.036

2016-12-29

云南省教育廳重大專項（ZD2014009）；2016云南省科技廳-云南中醫學院聯合專項（YN2016006）

羅燕（1992-），女，碩士研究生，研究方向為中藥資源開發與利用。

*通訊作者：趙聲蘭（1962-），女，教授，碩士，研究方向為藥食資源開發與利用。