序批式固定化菌液態(tài)發(fā)酵白酒工藝的研究

田梁，趙華*，鄭雅元，劉陽

（天津科技大學生物工程學院，天津300457）

序批式固定化菌液態(tài)發(fā)酵白酒工藝的研究

田梁，趙華*，鄭雅元，劉陽

（天津科技大學生物工程學院，天津300457）

以高粱糖化液為原料，采用序批式固定化菌液態(tài)發(fā)酵白酒工藝，酒精發(fā)酵最佳時間為36 h。以總酸、總酯含量為評價指標，利用均勻設計試驗方法，確定該工藝中固定化生香酵母、乳酸菌、己酸菌的最佳添加量。結果表明，得到液態(tài)發(fā)酵白酒的固定化菌株最佳添加量為生香酵母5.5%、乳酸菌1.0%、己酸菌3%，在此最優(yōu)條件下，總酸和總酯含量分別為486.62 mg/L和258.28 mg/L，且所釀白酒中酯類物質和高級醇含量均符合液態(tài)法白酒的國家標準。該工藝縮短了酒精發(fā)酵時間，并且提高了白酒品質。

均勻設計；固定化菌；液態(tài)發(fā)酵；白酒工藝；菌種配比

TIAN Liang,ZHAO Hua*,ZHENG Yayuan,LIU Yang
(College of Biotechnology,Tianjin University of Science and Technology,Tianjin 300457,China)

uniform design;immobilized microbe;liquid fermentation;Baijiuprocess;ratio of strains

傳統(tǒng)白酒生產大多采用固態(tài)發(fā)酵，其為手工操作，勞動強度大，且生產過程受氣候、環(huán)境等自然因素的影響較大，生產效率不高[1]。液態(tài)發(fā)酵白酒可實現白酒生產機械化操作，具有出酒率高、不用輔料、可供利用的原料品種多、生產效率高等優(yōu)點[2]，同時液態(tài)白酒也存在高級醇含量高而酯類含量不足的缺點。固定化技術是利用物理或者化學的方法，將游離的微生物細胞或酶定位在設定的空間區(qū)域內并維持其原有生物活性，使之成為連續(xù)流動的生物反應器且可被反復使用的一種生物技術。近年來，在對黃酒、啤酒、葡萄酒的研究中發(fā)現，固定化菌可以降低黃酒高級醇的含量、大幅度縮減啤酒發(fā)酵時間、提高葡萄酒的風味[3-5]。而在白酒中應用固定化菌的研究較少。

序批式固定化菌液態(tài)發(fā)酵白酒工藝，是以高粱糖化液為原料，先進行酒精發(fā)酵，然后利用固定化生香菌進行二次發(fā)酵。本試驗通過對發(fā)酵過程中總酸、總酯含量的檢測，利用均勻設計試驗方法優(yōu)化固定化生香菌的最佳添加量，旨在為新型液態(tài)發(fā)酵白酒工藝提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

生香酵母、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）：安琪酵母股份有限公司；乳酸菌、己酸菌：實驗室保藏菌種。1.1.2試劑

高粱：市售；糖化酶（10萬U/g）、耐高溫α-淀粉酶（酶活2000U/g）：諾維信生物有限公司；1%酚酞指示液、0.1mol/L NaOH標準溶液：天津市化學試劑五廠；0.1 mol/L硫酸標準溶液：天津市北方天醫(yī)化學試劑廠；海藻酸鈉、氯化鈣（純度98%）：天津市化學試劑一廠。

1.1.3 培養(yǎng)基

酵母培養(yǎng)基[6]：酵母膏1%、蛋白胨2%、葡萄糖2%、MgSO4·7H2O 0.02%、NH4Cl 0.2%、pH自然。

乳酸菌培養(yǎng)基[6]：蛋白胨1%，牛肉膏0.3%，NaCl 0.5%，pH 7.2。

己酸菌培養(yǎng)基[7]：體積分數95%乙醇溶液2%（滅菌后加入），NaAc 0.5%，酵母膏0.1%，MgSO4·7H2O 0.02%，K2HPO40.02%，（NH4）2SO40.05%，CaCO30.05%（干熱滅菌后加入），pH自然。

1.2 儀器與設備

Agilent 7890B氣相色譜（gas chromatography，GC）儀：美國安捷倫科技有限公司；HH-B11-420型電熱恒溫培養(yǎng)箱：天津市實驗儀器廠；HH-4可調型恒溫水浴鍋：天津市中環(huán)實驗電爐有限公司。

1.3 方法

1.3.1 序批式固定化菌液態(tài)發(fā)酵白酒工藝流程

操作要點：

（1）原料粉碎：取優(yōu)質高粱粉碎，過40目篩，加入3倍質量的水，打漿。

（2）液化：加入耐高溫α-淀粉酶5U/g，90℃液化60min，即得液化液。

（2）糖化：將液化液冷卻至室溫后，加入糖化酶80 U/g，在60℃條件下保溫糖化90 min，冷卻至30℃后過濾取上清液，即為糖化液。

（4）酒精發(fā)酵：在糖化液中接入1‰的釀酒酵母，30℃發(fā)酵36 h。

（5）固定化菌株二次發(fā)酵：在酒精發(fā)酵完成后的發(fā)酵液中加入固定化菌株，控制溫度30℃發(fā)酵5 d。

（6）蒸餾：蒸餾至酒精度為60%vol。

1.3.2 發(fā)酵時間對酒精發(fā)酵的影響

在高粱糖化液中接入1‰的釀酒酵母，于30℃條件下進行酒精發(fā)酵，在酒精發(fā)酵期間每隔4 h取樣測其酒精度，考察發(fā)酵時間對酒精發(fā)酵的影響，確定酒精發(fā)酵階段的最佳發(fā)酵時間。

1.3.3 固定化菌制備

在裝液量為100 mL/500 mL的酵母培養(yǎng)基中接入5‰生香酵母，30℃培養(yǎng)24 h；在裝液量為100 mL/250 mL的乳酸菌培養(yǎng)基中接入一環(huán)乳酸菌，30℃培養(yǎng)5 d；在裝液量為100 mL/250 mL的己酸菌培養(yǎng)基中接入一環(huán)己酸菌，35℃培養(yǎng)7 d[8-10]。

將上述菌液加入至一定量的2%海藻酸鈉中，混勻后，用注射器滴加至0.05 mol/L氯化鈣溶液中制成海藻酸鈉凝膠，于4℃下靜置過夜備用[11]，制成固定化菌。

1.3.4 檢測方法

酒精度及總酸、總酯含量的測定：參考GB/T 20821—2007《液態(tài)法白酒》中的方法。

風味物質成分的測定：采用氣相色譜法[12]。色譜條件：色譜柱：LZP-930（50 m×0.32 μm×1.00 mm）；載氣：氮氣；分流比：10∶1；流速：1 mL/min；進樣量：1 μL；進樣口溫度：200℃；檢測器溫度：200℃；升溫程序：初始溫度50℃，保持8 min后以5℃/min升溫至150℃，保持15 min；尾吹氣：50 mL/min；空氣流速：30 mL/min；氫氣流速：300 mL/min。

1.3.5 均勻試驗設計

根據單因素試驗結果，以總酸、總酯含量為評價指標，采用[U7（74）]均勻設計表[13]對固定化菌株生香酵母（X1）、乳酸菌（X2）、己酸菌（X3）的添加量進行優(yōu)化，均勻試驗設計因素與水平如表1所示。

表1 固定化菌添加量優(yōu)化均勻試驗因素與水平Table1 Factors and levels of uniform experiments for immobilized microbes addition optimization

2 結果與分析

2.1 發(fā)酵時間對酒精發(fā)酵的影響

在高粱糖化液中接入1‰的釀酒酵母，于30℃條件下進行酒精發(fā)酵，考察發(fā)酵時間對酒精發(fā)酵的影響，結果如圖1所示。

圖1 發(fā)酵時間對酒精發(fā)酵的影響Fig.1 Effect of fermentation time on alcohol fermentation

由圖1可知，隨著發(fā)酵時間的延長，發(fā)酵液中酒精度呈先增加后趨于平緩。當發(fā)酵至36 h時發(fā)酵液中酒精度為12.0%vol，繼續(xù)延長發(fā)酵時間，發(fā)酵液中酒精度增加不明顯，可能是由于發(fā)酵液中酵母菌可利用的營養(yǎng)物質減少，乙醇產量逐漸減低。因此選擇酒精發(fā)酵時間36 h為宜。通常以高粱為原料的酒精發(fā)酵時間為48 h[14]，與之相比該工藝縮短了酒精發(fā)酵時間。

2.2 單因素試驗結果

2.2.1 生香酵母添加量對總酸總酯變化的影響

在酒精發(fā)酵結束后，加入固定化乳酸菌4%、己酸菌4%及一定量的生香酵母（1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%），于30℃培養(yǎng)5 d后測定總酸、總酯含量，考察生香酵母添加量對總酸和總酯含量的影響，結果如圖2所示。

圖2 生香酵母添加量對總酸和總酯含量的影響Fig.2 Effect of aroma-producing yeast addition on the contents of total acid and total ester

由圖2可知，隨著生香酵母添加量的增加，總酸總酯的含量呈先增加后下降的趨勢。當生香酵母添加量為6%時，總酸和總酯含量達到最大值，分別為435.6mg/L和231.0mg/L；增加生香酵母添加量，總酸和總酯含量開始下降，因此，選擇固定化生香酵母最佳添加量6%為宜。

2.2.2 己酸菌添加量對總酸總酯變化的影響

在酒精發(fā)酵結束后，加入固定化的乳酸菌4%、生香酵母6%及一定量的己酸菌（1%、2%、3%、4%、5%、6%），于30℃培養(yǎng)5 d后測定總酸總酯含量，考察生香酵母添加量對總酸和總酯含量的影響，結果如圖3所示。

圖3 己酸菌添加量對總酸和總酯含量的影響Fig.3 Effect of caproic acid bacteria addition on the contents of total acid and total ester

由圖3可知，隨著己酸菌添加量的增加，總酸和總酯含量呈先增加后趨于平緩，當己酸菌添加量為3%時，總酸和總酯含量達到最大值，分別為447.2 mg/L和435.6 mg/L；增加生香酵母添加量，總酸和總酯含量變化不明顯。因此，選擇固定化己酸菌最佳添加量3%為宜。

2.2.3 乳酸菌添加量對總酸總酯變化的影響

在酒精發(fā)酵結束后，加入固定化的生香酵母6%、己酸菌3%及一定量的乳酸菌（1%、2%、3%、4%、5%、6%），于30℃培養(yǎng)5 d后測定總酸總酯含量，考察乳酸菌添加量對總酸和總酯含量的影響，結果如圖4所示。

圖4 乳酸菌添加量對總酸和總酯含量的影響Fig.4 Effect of lactic acid bacteria addition on the contents of total acid and total ester

由圖4可知，隨著乳酸菌添加量的增加，總酸含量呈先增加后下降，總酯含量呈先增加后趨于平緩，當生乳酸菌添加量為3%時，總酸和總酯含量達到最大值，分別為450.5 mg/L和235.7mg/L；增加生香酵母添加量，總酸含量開始下降，而總酯含量變化不明顯。因此，選擇固定化乳酸菌最佳添加量3%為宜。

2.3 均勻試驗結果

在單因素試驗結果的基礎上，對固定化菌種生香酵母（X1）、乳酸菌（X2）、己酸菌（X3）的添加量進行均勻優(yōu)化試驗，均勻試驗設計及結果見表2。采用DPS數據處理軟件對各因素及交互作用項逐步進行回歸分析[15]，結果如表3所示。

表2 固定化菌添加量優(yōu)化均勻試驗設計與結果Table 2 Design and results of uniform experiments of immobilized microbes addition optimization

表3 均勻試驗的逐步分析結果Table 3 Results of stepwise analysis of uniform experiments

Y1、Y2回歸模型優(yōu)化擬合方程如下：

由表3可知，總酯含量與固定化菌添加量擬合回歸方程相關系數R=0.999 99，調整后的相關系數Ra=0.999 9，總體顯著性檢驗值F=10 255.442 6，顯著水平P=0.007 5，剩余標準差（surplus standard deviation，SSE）為0.660 3，因此該方程的可信度高。對回歸方程用非線性規(guī)劃方法進行優(yōu)化，可以得出菌種添加量最優(yōu)配比X1=5.58，X2=0.98，X3=3.0，結合實際生產將其代入上述回歸方程，得到總酯含量最大預測值為490 mg/L。

總酯含量與固定化菌添加量擬合回歸方程相關系數R=0.999 957，調整后的相關系數Ra=0.999 74，總體顯著性檢驗值F=2319.7267，顯著水平P=0.0152，剩余標準差（SSE）為0.576 6，因此該方程的可信度高。可以得出菌種添加量最優(yōu)配比X1=5.71，X2=1.00，X3=2.87，結合總酯優(yōu)化條件，選擇X1=5.5，X2=1.0，X3=3.0將其代入上述回歸方程，得到Y2（總酸含量）最大預測值為258.34 mg/L。

2.4 驗證試驗

采用經優(yōu)化后的固定化菌添加量進行發(fā)酵，即生香酵母5.5%、乳酸菌1.0%、己酸菌3%，驗證試驗重復3次，測得發(fā)酵液中總酯和總酸含量平均值分別為486.62 mg/L和258.28 mg/L，均與模型預測值相差不大。

2.5 酒質的分析

在優(yōu)化后的發(fā)酵時間和最佳固定化菌添加量的條件下，進行序批式固定化菌液態(tài)發(fā)酵，蒸餾到酒精度為60.0%vol，采用氣相色譜法對所釀造白酒中主要風味成分進行檢測，檢測結果見表4。

由表4可知，酒液中乙酸乙酯和乳酸乙酯含量達到2.05 g/L和0.67 g/L，而且含有4種高級醇正丙醇、異丁醇、異戊醇和苯乙醇，其含量分別為0.37 g/L、0.62 g/L、0.87 g/L、0.26g/L，其酯類物質和高級醇含量均達到國標GB/T20821—2007《液態(tài)法白酒》的要求[16]。結果表明，序批式固定化菌液態(tài)發(fā)酵白酒工藝可以提高液體發(fā)酵白酒品質。

表4 白酒風味成分氣相色譜檢測結果Table 4 Detection results of flavor compound analysis by gas chromatography

3 結論

本研究采用均勻試驗設計，對序批式固定化菌液態(tài)發(fā)酵白酒工藝中酒精發(fā)酵時間及固定化菌種添加量進行了優(yōu)化。結果表明，酒精發(fā)酵時間為36 h，固定化菌最佳添加量為生香酵母5.5%、乳酸菌1.0%、己酸菌3.0%，在此最佳條件下發(fā)酵，總酸和總酯含量分別為486.62mg/L和258.28mg/L。蒸餾到酒精度為60.0%vol時，酒液中乙酸乙酯和乳酸乙酯含量達到2.05 g/L和0.67 g/L，正丙醇、異丁醇、異戊醇和苯乙醇，其含量分別為0.37 g/L、0.62 g/L、0.87 g/L、0.26 g/L，其酯類物質和高級醇含量均達到液態(tài)法白酒國家標準，序批式固定化菌液態(tài)發(fā)酵白酒工藝提高了液體發(fā)酵白酒品質，為序批式固定化菌液態(tài)發(fā)酵白酒提供了理論依據。

[1]周振明，柳剛，何金鳳，等.固態(tài)發(fā)酵白酒生產工藝過程分析[J].食品工程，2014（2）：51-52.

[2]張昊，陳亮，王繼富，等.液態(tài)發(fā)酵法白酒生產技術的研究[J].中國石油和化工標準與質量，2013（24）：82.

[3]譚檑華.黃酒固定化發(fā)酵及高級醇含量的控制研究[D].杭州：浙江工商大學，2012.

[4]程江峰，何慶.蜂窩陶瓷固定化酵母細胞啤酒連續(xù)后發(fā)酵工藝的研究[J].食品研究與開發(fā)，2006，27（4）：46-48.

[5]徐建東，單春會，童軍茂.細胞固定化在釀造葡萄酒中的應用[J].食品研究與開發(fā)，2010，31（12）：18-22.

[6]杜連祥，路福平.微生物學實驗技術[M].北京：中國輕工出版社，2005：348-356.

[7]姚萬春，唐玉明，任道群，等.不同泥厚窖泥主要功能菌及代謝產物研究[J].中國釀造，2012，31（12）：44-47.

[8]陸振群.產酯類酵母菌的選育[D].蕪湖：安徽工程大學，2012.

[9]胡曉龍.濃香型白酒窖泥中梭菌群落多樣性與窖泥質量關聯(lián)性研究[D].無錫：江南大學，2015.

[10]彭兵，祝熙，李忠奎，等.窖泥高產己酸菌分離鑒定及培養(yǎng)條件優(yōu)化的研究[J].中國釀造，2016，35（5）：43-46.

[11]李超敏，韓梅，張良，等.細胞固定化技術—海藻酸鈉包埋法的研究進展[J].安徽農業(yè)科學，2006，34（7）：1281-1282.

[12]陸海波.淮山藥清酒工藝研究[D].天津：天津科技大學，2016.

[13]方開泰，馬長興.正交與均勻試驗設計[M].北京：科學出版社，2001：35-125.

[14]谷立秋，金明亮，劉輝，等.甜高粱汁發(fā)酵酒精培養(yǎng)基的優(yōu)化研究[J].中國釀造，2013，32（S1）：57-58，61.

[15]甘桂蘭，程新，李昆太.DPS數據處理軟件在發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化中的應用[J].中國釀造，2008，27（21）：69-71.

[16]全國食品工業(yè)標準化技術委員會釀酒分技術委員會.GB/T 20821—2007.液態(tài)法白酒[S].北京：中國標準出版社，2007.

TS262.3

0254-5071（2017）05-0109-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.05.023

2016-12-26

田梁（1990-），女，碩士研究生，研究方向為現代釀造技術。

*通訊作者：趙華（1963-），男，教授，博士，研究方向為現代釀造技術。