適用于橘子酒發酵的野生酵母初步篩選

陳清嬋，孫愛紅，簡清梅，王勁松

（荊楚理工學院生物工程學院，湖北荊門448000）

適用于橘子酒發酵的野生酵母初步篩選

陳清嬋，孫愛紅，簡清梅，王勁松

（荊楚理工學院生物工程學院，湖北荊門448000）

從橘子果肉中分離篩選出酵母菌4株，分別命名為JZ-1、JZ-2、JZ-3、JZ-4。4株酵母均具有典型圓形酵母屬特征。經過對4株酵母的發酵力及所釀橘子酒的香氣、色澤、風味等感官指標進行綜合評價、比較。結果表明，菌株JZ-1發酵速度快，降糖徹底，產酒精能力強，釀造的橘子酒具有較好的橘子果酒的典型性，酒體色度好，為澄清透亮的黃色，酒液酒精度達到9.2%vol，殘糖量為10.4 g/L。關鍵詞：橘子酒；果酒酵母；篩選

CHEN Qingchan,SUN Aihong,JIAN Qingmei,WANG Jinsong
(College of Bioengineering,Jingchu University of Technology,Jingmen 448000,China)

橘子是一種較常見的水果，也是一種極佳的釀酒原料。它富含維生素C和檸檬酸，具有美容和消除疲勞的作用。以橘子為原料釀造的酒，酒精度低、營養價值高，也滿足人們日益增長的養生需求[1]。因此，研制開發發酵型柑橘果酒不僅可大大提高柑橘的附加值，而且將成為極受歡迎的新型食品[2]。

由于葡萄酒的生產工藝已經成熟，好多果酒的研發都是參照葡萄酒，這使得研發的其他果酒口感不好、風味欠佳、果香不典型。所以沒有商品化的橘子釀酒專用的酵母，是橘子酒生產和發展的一大阻礙。沒有適宜的菌種，就釀制不出優質的果酒[3]。生產實踐證明，菌種是果酒釀造的必要條件[4]，橘子酒的釀造也不例外。目前柑橘果酒的酵母多為延用葡萄酒酵母或果酒干酵母[5]。

目前有研究者從自然環境中分離柑橘釀酒酵母并對其進行鑒定[6]和特性研究[7-8]，也對非發酵酵母[9]和生香酵母進行了篩選[10]，比較不同酵母對柑橘果酒香氣的影響[11]。本研究以荊門本地橘子為試材，從橘子果肉中分離酵母菌，通過對其發酵能力、產酒色度、產酒品質等性能的研究篩選出具有良好發酵性能的天然野生酵母，用于橘子酒的發酵。目的是為橘子酒的產業化生產奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

橘子：荊門當地市售；馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potatodextrose agar，PDA）培養基：青島高科因海博生物技術有限公司；亞硫酸（分析純）：天津市東麗區天大化學試劑廠；蔗糖（分析純）：鄭州盛源化工產品有限公司；葡萄糖（分析純）：吳江市恒達精細化工有限公司；2,6-二氯酚靛酚（分析純）：杭州長青化工有限公司；抗壞血酸（分析純）：武漢大華偉業醫藥化工有限公司；酒石酸鉀鈉（分析純）：湖北興眾誠科技有限公司；硫酸銅（分析純）：廣州市意強化工有限公司；亞鐵氰化鉀（分析純）：廣州市南福化工有限公司；氫氧化鈉（分析純）：安慶安通化工有限公司。

1.2 儀器與設備

DH-600型電熱恒溫培養箱：北京科偉永興儀器有限公司；ES-315高壓蒸汽滅菌鍋：上海博迅實業有限公司醫療設備廠；TU-1901型紫外分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司；JJ-CJ-2FD型超凈工作臺：蘇州金凈科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 橘子酒工藝流程

橘子→去皮→壓榨→制漿→調糖→發酵→澄清、過濾

橘子成熟后（無須過熟）去皮，榨汁，將果渣與果汁混合。于果漿中加亞硫酸調整二氧化硫質量濃度為60 mg/L，用蔗糖調整可溶性固形物含量為20.0%，分別將各菌株的培養液按5%的體積比例接入到200mL橘子汁中，搖勻后放入25℃培養箱中恒溫發酵，發酵時間為7 d。發酵結束后過濾，棄濾渣，于濾汁中加入硅藻土0.7 g/L，低溫澄清24 h，虹吸上清液，獲得澄清橘子酒。

1.3.2 橘子酒酵母的分離、純化及篩選

（1）橘子酒酵母的分離、純化

分別從放置2 d的橘子果肉中取得菌懸液，在30℃、PDA培養基上平板培養3 d，觀察菌落情況，然后對菌體進行鏡檢，分離出單個菌落，逐步進行分離、純化[12]。取合適的菌體反復進行平板培養、分離、觀察、鏡檢，將適宜菌株轉移至試管斜面PDA培養基于30℃進行增殖培養，3 d后轉移到4℃冰箱保藏備用[13]。

（2）菌落形態學鑒定

參照《真菌鑒定手冊》[14]和《酵母菌的特征與鑒定手冊》[15]，對酵母進行形態學鑒定。

（3）菌種擴大培養

從斜面培養基上取一環活化菌種接入50 mL經滅菌處理的橘子清汁中，28℃搖床培養24h，振蕩速度120 r/min[13]。

（4）酵母發酵力的測定

CO2失重法：取320 mL可溶性固形物含量為20.0%橘子汁于121℃高壓滅菌30 min后，分別裝到4個經滅菌處理的100 mL三角瓶中，每瓶80 mL，再分別接入2 mL各菌株擴大培養液，25℃培養7 d，測定其發酵液質量損失，并對各菌種發酵能力進行評價。

（5）菌株發酵速度的測定

分別向200 mL橘子汁發酵醪中添加2 mL[16]的各菌株擴大培養液，25℃恒溫發酵7 d，通過定期測定發酵醪的含糖量變化，繪圖比較各篩選菌株發酵速度的高低[17]。

（6）酵母對發酵酒液色度的影響

比色法：用TU-1910型紫外分光光度計，在波長520nm條件下用1 cm比色杯測各菌種發酵酒液的吸光度值，蒸餾水作為空白，比較各菌種對酒液色度的影響。

（7）酵母對釀造酒液感官評定的影響

表1 不同酵母釀造的橘子酒感官評分標準Table 1 Sensory evaluation standards of orange wine fermented by different yeasts

將發酵好的橘子酒給10位師生進行感官評定，結合GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[18]，制定感官評分標準見表1，滿分100分。取10位成員評分的平均值為最終得分。

1.3.3 測試指標與方法

可溶性固形物含量：手持糖度計法。

殘糖含量（以葡萄糖計）：斐林試劑法[19]，10 mL斐林試劑液相當于葡萄糖51.33 mg。

維生素C（vitaminC，VC）含量：2,6-二氯酚靛酚滴定法[19]。

澄清度：比色法。用可見分光光度計，在波長680 nm條件下，用1 cm比色杯測定透光度（T%），蒸餾水做空白。

色度：比色法。用可見分光光度計，在波長520 nm條件下，用1 cm比色杯測定吸光度值（A），蒸餾水作為空白。

酒精度：蒸餾法。用容量瓶取100 mL酒樣于500 mL蒸餾瓶中，50 mL水洗容量瓶并并入蒸餾瓶中，收集餾出液100 mL，冷卻后用酒精計測量并按20℃校正。

1.3.4 數據處理

所有試驗指標測定3次，取平均值；試驗數據用Excel軟件處理。

2 結果與分析

2.1 橘子酒酵母的分離、純化及形態鑒定

反復進行多次分離、純化，得到了符合酵母特征的初篩酵母菌4株，分別命名為JZ-1、JZ-2、JZ-3、JZ-4。4株菌株在PDA培養基上30℃培養3 d后，觀察其菌落形態，酵母的菌落及個體形態結果如表2所示。

表2 酵母的菌落及個體形態Table 2 Colonies and individual morphology of yeast strains

由表2可知，從橘子中分離出天然野生酵母，且其菌落特征和菌體特征都差不多相似，同屬于圓形酵母屬。

2.2 橘子酒酵母的初步篩選

2.2.1 酵母發酵力的確定

將篩選出的酵母菌株，分別接入橘子汁培養基中，25℃恒溫培養，連續7 d測發酵液質量損失，至相鄰兩次質量之差小于0.2 g為發酵終點，終止發酵。判斷酵母發酵力，具體情況如表3所示。

由表3可知，各菌株在25℃條件下恒溫發酵7 d后，發酵液質量損失分別為：菌株JZ-1 11.83 g、JZ-2 9.78 g、JZ-3 10.84 g、JZ-4 10.13 g。由發酵液質量損失大小即CO2釋放量可知，不同菌株利用蔗糖發酵產生酒精的能力各不相同，即各菌株的發酵力不同。由表3可以看出，各發酵液質量損失率大小如下：JZ-1酵母＞JZ-3酵母＞JZ-2酵母＞JZ-4酵母。所以菌株JZ-1的發酵力最強。

表3 不同菌株發酵液質量變化Table 3 Mass changes of fermentation must by different yeasts

分別將各菌株的擴大培養液按5%的體積比接入到200 mL橘子汁中，搖勻后放入25℃培養箱中恒溫發酵7 d。測定發酵酒液糖含量，其含量變化結果見圖1。

圖1 各菌株發酵期間發酵液的降糖速度比較Fig.1 Sucrose-decreasing speed comparison in fermentation must by different yeasts

由圖1酒液殘糖含量變化曲線可以看出，菌株JZ-1、JZ-2、JZ-3、JZ-4在蔗糖含量為20%的橘子汁發酵醪中迅速發酵，起酵時間基本一致，均為1 d。酵母菌JZ-1發酵速度快，降糖徹底（第7天糖含量已降至7.2%），發酵能力強，最終釀造酒精度高；JZ-4酵母菌發酵速度較慢，至第5天后降糖速度趨于平緩，殘糖含量高（第7天糖含量仍為8.3%），酒精度較低；而酵母菌JZ-2發酵速度接近酵母菌JZ-4（第7天糖含量為8.0%），發酵速度較緩慢，酒精度較低；JZ-3酵母介于JZ-1酵母和JZ-2酵母之間（第7天糖含量為7.5%），發酵能力較強，最終釀造酒精度較高。

相對而言，菌種發酵力越大，它的發酵速度越快而且越徹底，而酒中殘糖含量就越少，發酵性能越優良。菌株JZ-1的發酵性能最好。

2.2.2 產酒色度測定

將發酵好的橘子酒進行澄清，用紫外分光光度計在波長520 nm下測定各菌種發酵酒液的吸光度值，結果如表4所示。

表4 各酵母發酵酒的色度Table 4 The color density of orange wine fermented by different yeasts

橘子酒透明，色澤為黃色或金黃色為佳，酒的吸光度值越大，酒體色澤相對越差。如表4可知，各菌釀造的橘子酒吸光度值大小為JZ-4＞JZ-3＞JZ-1＞JZ-2。酵母菌JZ-2釀造橘子原酒，色澤為淡黃色，酒體透明；酵母菌JZ-1釀造橘子原酒，色澤黃色，酒體透明度較好；酵母菌JZ-3和JZ-4釀造的橘子原酒呈深黃色，酒體略渾濁。就色澤來說，酵母菌JZ-1和JZ-2酵母所釀原酒的酒色最好。

2.2.3 綜合評定

根據各篩選酵母菌釀酒感官評分標準要求，對篩選出的4株酵母菌所釀原酒進行感官評定，具體評定結果見表5。

表5 各酵母菌釀造的橘子酒感官評價Table 5 Sensory evaluation of orange wine fermented by different yeasts

由表5看出，各初篩菌種發酵原酒感官評分由大到小順序：JZ-1＞JZ-3＞JZ-4＞JZ-2。根據感官評價得知，酵母JZ-1為最好菌株。

綜合以上的結果可以看出，酵母菌JZ-1發酵速度快，發酵力強，產酒精的能力高，色度不錯，具有良好的橘子酒典型性，釀酒效果佳。酵母菌JZ-3發酵力不錯，風味和色度方面較好；酵母菌JZ-2、JZ-4發酵力不強，酵母菌JZ-2風味、釀酒色度等綜合性都較差，但酵母菌JZ-4釀酒橘子香味濃，典型性好。綜合分析，在從橘子果實中篩選的天然野生酵母中，酵母菌JZ-1性能最佳。

2.2.4 優選菌所釀橘子酒的理化指標

對酵母菌JZ-1發酵所得橘子酒進行澄清，對其VC含量、酒精度、殘糖含量、透光率等理化指標進行測定，結果見表6。

表6JZ-1酵母所釀造的橘子酒的理化指標Table 6 Physicochemical indexes of orange wine fermented by yeast JZ-1

由表6可知，酵母JZ-1釀造的橘子酒VC含量較高（含量15.4 mg/100 mL），營養價值很好；酒精度適宜（酒精度9.2%vol），降糖較徹底；酒體透明度高（透光率88.9%），色澤較好；糖量較少屬于半干型，符合果酒標準[20]，是低酒精度營養型果酒。

3 結論

從橘子果肉中分離出的4種酵母菌株其菌落特征、菌體形態較為相近，內部有菌核，出芽生殖；菌落均呈白色，圓形，有一定凸起度，易挑起。4株酵母中，菌株JZ-1和JZ-3的發酵力、產酒精率性能均較強，尤以菌株JZ-1綜合性能最好。酵母菌JZ-1釀造的橘子酒VC含量較高，產酒精能力強，降糖較徹底，酒體透明度高，色澤較好。綜合分析認為，在從橘子果實中篩選的天然野生酵母中，菌株JZ-1的性能最佳。后期需要對菌株JZ-1進行生理生化實驗及分子生物學鑒定，并進行特性研究，在此基礎上優化橘子酒發酵工藝，提高橘子酒發酵品質。

[1]李建婷，張曉丹，秦丹.我國柑橘類果酒的研究現狀[J].農產品加工，2016（6）：62-65.

[2]陳瑤，賴崇德，劉玄，等.橙汁釀酒酵母菌株的分離篩選和發酵性能的測定[J].江西農業大學學報，2007，29（4）：665-669.

[3]楊幼慧，張莉萍，鄭素霞.影響果酒發酵質量的因素及其控制方法[J].中國釀造，2002，21（1）：28-31.

[4]羅安偉.獼猴桃酒生香嗜殺酵母的選育[D].楊凌：西北農林科技大學，2012.

[5]何彩梅.柑橘果酒釀造工藝研究進展[J].中國釀造，2016，35（3）：10-12.

[6]艾方，胡慧磊，彭麗桃.發酵柑桔汁中產香酵母的篩選及生長特性研究[J].中國釀造，2010，29（4）：67-70.

[7]何平.柑橘酒釀造工藝研究[J].武漢：湖北工業大學，2007.

[8]劉國庫，丁亞光，胡勝男，等.柑橘果酒酵母菌發酵特性的研究[J].食品與發酵科技，2014，50（1）：81-84.

[9]劉瑞，陳福生，張秀艷.橘園分離的非釀酒酵母的耐受性分析[J].中國釀造，2015，34（3）：20-23.

[10]劉陽，鄧靜，吳華昌，等.柑橘果皮中生香酵母的篩選及揮發性香氣成分分析[J].食品安全質量檢測學報，2014，5（12）：4050-4055.

[11]李銳，馮奎，吳婧，等.不同來源釀酒酵母對柑橘果酒香氣成分的影響[J].食品科學，2010，31（17）：206-213.

[12]劉建軍，張家祥.高產酒精酵母菌種的選育[J].釀酒，2003（1）：57-59.

[13]趙鈴艷，鄧放明，揚撫林.自然發酵辣椒中優良乳酸菌的分離與鑒定[J].食品研究與開發，2004，25（3）：105-108.

[14]魏景超.真菌鑒定手冊[M].第1版.上海：上海科學技術出版社，1979：102-117.

[15]巴尼特A，佩恩RW，亞羅D.酵母菌的特征與鑒定手冊[M].胡瑞卿譯.青島：青島海洋出版社，1991：20-28.

[16]尚云青.新型營養獼猴桃果酒加工技術研究[J].食品科技，2002（2）：53-54.

[17]徐清萍，朱廣存.野生獼猴桃果酒酵母的篩選鑒定及耐受性的研究[J].中國釀造，2011，30（7）：120-123.

[18]全國食品工業標準化技術委員會釀酒分技術委員會.GB/T 15038—2006葡萄酒、果酒通用分析方法[S].北京：中國標準出版社，2006.

[19]吳謀成.食品分析與感官評定[M].第1版.北京：中國農業出版社，2002.

[20]中國綠色食品發展中心.NY/T 1508—2007綠色食品果酒[S].北京：中國標準出版社，2007.

TS262.7

0254-5071（2017）05-0128-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.05.027

2016-11-17

湖北省教育廳科學研究計劃資助項目（Q20154304）

陳清嬋（1983-），女，講師，博士，研究方向為風味食品。