篤斯越橘酰化花青素穩定性分析

朱良玉，周麗萍，王化，李夢莎，張悅，沈光*

（黑龍江省科學院自然與生態研究所，黑龍江哈爾濱150040）

篤斯越橘酰化花青素穩定性分析

朱良玉，周麗萍，王化，李夢莎，張悅，沈光*

（黑龍江省科學院自然與生態研究所，黑龍江哈爾濱150040）

采用分光光度法，通過多梯度、多組合系列試驗，對光照、溫度、金屬離子、氧化劑、還原劑等因素下的篤斯越橘酰化花青素和篤斯越橘花青素的穩定性進行比較分析。研究表明，與未酰化的花青素相比，酰化花青素耐光性提高，各種環境里的抗色素分解能力增加。Fe2+、Fe3+、Cu2+對無論酰化與否的花青素都會產生不同程度的不利影響，在色素應用過程中（加工、保存及運輸）應避免與其接觸。結果證明，篤斯越橘酰化花青素穩定性優于未經修飾的花青素，有較高的開發應用和研究價值。

篤斯越橘；花青素；酰化修飾；穩定性

ZHU Liangyu,ZHOU Liping,WANG Hua,LI Mengsha,ZHANG Yue,SHEN Guang*
(Institute of Natural Resources and Ecology,Heilongjiang Academy of Sciences,Harbin 150040,China)

篤斯越橘（Vaccinium uliginosumLinn.）是我國野生藍莓品種，其富含的花青素是一種天然食用色素，具有抗氧化活性，清除自由基，延緩衰老等功效，有極高的研究開發價值[1-3]。但是由于花青素自身的不穩定特性，限制了其應用范圍，降低了花青素在加工和使用過程中的利用率[4-6]。

影響花青素穩定性的原因是花青素的化學結構和其高活性。一般情況下，甲基化程度提高可使其穩定性增加，羥基化程度提高會使其穩定性下降[7]。溫度、pH、光、金屬離子、抗壞血酸、糖及其降解產物等因素也會對其產生影響[8]。因此，貯藏加工方式不同對花青素穩定性產生不同影響。通常情況下，天然色素在低溫或干燥狀態時較穩定，加熱或高溫可加快變色反應[9-12]。金屬離子也對花青素穩定性產生影響。楊萬政等[13]研究玫瑰花紅色素的穩定性時發現，Fe3+引起色素溶液變黑。杜連啟等[14]研究紫甘薯色素穩定性的結果表明，Cu2+、Zn2+、Fe3+等離子在一定程度上影響色素的穩定性，放置時間越長，吸光度值越小。

已有研究表明，酰化花色苷相對來說具有較高的穩定性[15]，GIUSTI M M等[16]用肉桂酸和丙二酸酰化的花色苷在常溫下可保存6個月。酰化花色苷對pH值的改變、溫度和光照等均表現出較強的穩定性。張智等[6]研究酸對藍靛果花色苷穩定性的影響結果表明，對羥基苯甲酸能顯著提高藍靛果花色苷的穩定性。

在前期試驗中采用Novozym435脂肪酶法輔助軟脂酸對篤斯越橘花青素進行化學修飾，通過吸光度值的改變來計算保存率作為評價指標。利用紫外、紅外圖譜掃檢測驗證其酰化。最終測得其保存率為87.40%，紫外圖譜中花色苷在波長300～330 nm左右有吸收峰且可見光區最大吸收峰有右移，紅外圖譜中，在波數為1 650～1 750 cm-1之間有較強的紅外吸收峰，推測該羰基基團應當與共軛基團相連，得到酰化后的花青素。以此為原料，探討不同溫度、光照、金屬離子、氧化劑對酰化后花青素穩定性的影響，為花青素的酰化研究提供數據參考及理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

篤斯越橘：大興安嶺市售。

無水乙醇（分析純）、過氧化氫（分析純）、氯化鉀、氯化鈉、氯化鈣、氯化鎂、硫酸亞鐵、氯化鐵、硫酸銅：天津市科密歐化學試劑有限公司；亞硫酸鈉（分析純）：北京化工廠。

1.2 儀器與設備

DK-98-11A恒溫水浴鍋：天津市泰斯特儀器有限公司；LGJ-18冷凍干燥機：北京松源華興科技發展有限公司；FA2004電子分析天平：上海天平儀器廠；DZF-6053真空干燥箱：上海恒科技有限公司；Re-52CS真空旋轉蒸發儀：上海圣科儀器設備有限公司；PHS-3D精密pH計：上海精科儀器；ZD-85恒溫震蕩器：國華企業集團有限公司；UV-1700USA紫外分光光度計：天津市泰斯特儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 花青素的提取與酰化方法

篤斯越橘花青素的提取采用體積分數70%的乙醇，料液比1∶20（g∶mL），室溫條件下浸提1 h后超聲波提取30 min，超聲溫度35℃，超聲功率100 W，過濾取上清液，在45℃條件下進行旋轉蒸發濃縮，得到花青素的粗提液。大孔樹脂X-5進行純化，體積分數為70%乙醇洗脫，洗脫液旋轉蒸發濃縮，凍干后得到酰化前的大興安嶺篤斯越橘花青素粉體。

選擇軟脂酸作為酰基供體，篤斯越橘花青素與軟脂酸和Novozym435脂肪酶的質量比為1∶4∶1，反應pH4、時間4h、溫度50℃，反應后凍干后得到酰化后的大興安嶺篤斯越橘花青素粉體。

分別量取1.00 g的酰化前后的大興安嶺篤斯越橘花青素粉體溶于1 000 mL的蒸餾水中，在紫外可見分光光度計下經250～700 nm全光譜掃描，確定未轉化樣品最大吸收波長531 nm為其檢測波長。酰化后花青素檢測波長為其最大吸收波長536 nm。調節酰化前后其吸光度值約為0.70，作為試驗用樣。

1.3.2 溫度對花青素穩定性的影響

取酰化前用樣和酰化后用樣各300 mL，分裝6份，每份50 mL，室內自然光照，分別置于50℃、60℃、70℃、80℃、90℃的恒溫水浴鍋中2h后于波長531nm和536nm處測量吸光度值，分析溫度對花青素及其酰化后產物穩定性的影響。

1.3.3 光照對花青素穩定性的影響

采用的花青素材料同上，取樣150 mL，分裝3份，每份50mL，在室溫條件下分別置于室內自然光照、日光燈（30W）照射和避光環境（實驗臺下背光柜櫥中），每天定時測量各自最大吸收波長下的吸光度值，共觀測49 d，分析光照對花青素及其酰化后產物穩定性的影響。

1.3.4 氧化劑和還原劑對花青素穩定性的影響

采用的花青素材料同上，取樣100 mL，分裝2份，每份50 mL，在室溫自然光照條件下分別加入與樣液1∶1體積的10%的過氧化氫溶液和亞硫酸鈉溶液。分別隔1h、6h、12h、24h、48h測量各自最大吸收波長下的吸光度值，共測定5次，分析氧化劑和還原劑以及其濃度對花青素及其酰化后產物穩定性的影響。

1.3.5 金屬離子對花青素穩定性的影響

采用的花青素材料同上，取樣350 mL，分裝7份，每份50 mL，在室溫自然光照條件下分別加入與樣液1∶1體積的0.10 mol/L的K+、Na+、Ca2+、Mg2+、Fe2+、Fe3+、Cu2+不同金屬離子溶液。室溫靜置1 d，測量各自最大吸收波長下的吸光值，并觀察溶液顏色變化，分析金屬離子對花青素及其酰化后產物穩定性的影響。

以上實驗均做3次平行，取其平均值做單因素分析。

2 結果與分析

2.1 溫度因素下花青素酰化前后穩定性比較

溫度對花青素酰化前后吸光度值的影響見圖1。由圖1可知，通過水浴鍋加溫實驗，隨著溫度的升高，樣品的吸光度值呈現降低的趨勢，酰化花青素吸光度值整體上明顯高于酰化前樣品，尤其是當溫度高于60℃以后，花青素樣品的耐溫性顯著低于酰化物樣品，說明酰化暫緩了花青素的降解，增強了花青素的穩定性，使其耐溫性有所提高，僅從這一點上看，酰化花青素對于工業生產過程中的高溫具有一定程度的耐受性。

圖1 溫度對花青素酰化前后吸光度值的影響Fig.1 Effect of temperature on the absorbance of anthocyanins before and after acylation

2.2 光照因素下花青素酰化前后穩定性比較

置于室內自然光照、日光燈直射和避光環境下的花青素在酰化前后的吸光度值隨時間的變化見圖2。

由圖2可知，三種條件下都呈現隨著時間的延長，吸光度值降低的趨勢，即保存率逐漸降低。以上三種光環境下，3 d之內花青素酰化前后吸光值變化差別都不大，3 d之后兩者吸光度值差別逐漸加大，且三種光環境條件下吸光度值差別顯著，說明三種光環境對花青素吸光度的影響有明顯區別。

三種光環境下處理84 d后花青素酰化前后吸光度值比較結果見表1。持續燈光和自然光照條件相比，持續燈光處理加速了花青素的降解，在84 d時酰化前后花青素的吸光度值分別是0.37和0.52，自然光條件84 d時，吸光度值分別是0.42和0.56，可見直射燈光比自然光更不利于花青素的保存；相比而言，避光環境有利于色素的穩定性，三種光環境下酰化物的光穩定性都優于未酰化產物，光照下從第14天開始，酰化產物的吸光度值明顯高于未酰化物，說明酰化物光穩定性有了顯著提高。避光保存下，1～14 d之間花青素吸光度值下降緩慢，酰化樣略高于未酰化花青素，14 d后酰化樣開始明顯高于未酰化樣。總體來看，酰化后花青素耐光性明顯高于未酰化樣品。

圖2 自然光照（A）、日光燈（B）、避光環境（C）對花青素酰化前后吸光度值的影響Fig.2 Effects of natural light(A),fluorescent lamp(B)and dark environment(C)conditions on the absorbance value before and after anthocyanins acylation

表1 三種光環境下處理84 d對花青素酰化前后吸光度值的影響Table 1 Effect of three kinds of light treatments for 84 d on the absorbance value of anthocyanins before and after acylation

2.3 氧化劑和還原劑下花青素酰化前后穩定性比較

向體系中分別加入過氧化氫和亞硫酸鈉，考察氧化劑和還原劑對花青素酰化前后吸光度值的影響，結果見圖3。

圖3 過氧化氫（A）和亞硫酸鈉（B）對花青素酰化前后吸光度值的影響Fig.3 Effect of hydrogen peroxide(A)and sodium sulfite(B)on the absorbance value of anthocyanins before and after acylation

由圖3A可知，酰化樣品加入過氧化氫溶液在短時間內吸光度值增加，1 h后吸光度值隨著時間的增加而逐漸減少；而未酰化樣品在1 h內吸光度值快速下降至約0.20，然后隨著時間的增加吸光度值減小速度過緩，直至48 h達到0.12左右。這說明就吸光度值而言酰化后花青素穩定性增加，適應性強，有著很好的抗氧化能力，對于提高花青素的穩定性有積極作用。

由圖3B可知，花青素酰化吸光度值的變化趨勢與加入過氧化氫一樣，但變化幅度相對較小。不同的是未酰化樣吸光度值在1 h時升高，隨后急劇下降，酰化后花青素始終呈降低趨勢。在48 h后，酰化前后花青素吸光度值逐漸趨于一致。原因可能是由于亞硫酸鈉為強還原劑，具有漂白作用，與花青素反應生成絡合物，降低了花青素溶液的吸光度值，酰化后的花青素對還原劑的耐性一般，并不高于未酰化后花青素。

2.4 金屬離子因素下花青素酰化前后穩定性比較

七種金屬離子的添加對花青素溶液吸光度值的影響見圖4。酰化后花青素的吸光度相對于未酰化樣品顯著增加，但同時也產生了不同程度的絮狀物，金屬離子對花青素酰化前后顏色變化的影響結果見表2。

圖4 金屬離子對花青素酰化前后吸光度值的影響Fig.4 Effect of metal ions on the absorbance value of anthocyanins before and after acylation

由圖4可知，加入金屬離子后花青素酰化前后吸光度值明顯增加，以加入Ca2+離子的溶液吸光度值增加的幅度最大，其次是Mg2+、K+、Na+、Fe2+。Fe3+和Cu2+的吸光度值相對增加較小。就吸光度值而言，酰化后花青素穩定性增加，對于提高花青素的穩定性有積極作用。但是添加金屬離子使花青素穩定性產生影響還表現在花青素的顏色變化上，因此結合考察金屬離子對花青素酰化前后顏色的影響。

由表2可知，加入金屬離子后花青素酰化前后顏色變化比較，未酰化樣品添加Fe2+溶液呈灰紫有黑色沉淀物，Fe3+添加溶液呈黃灰色有灰色沉淀物，添加Cu2+為無色，添加其他離子溶液澄清呈粉紅色。酰化樣品Fe2+添加后呈灰紫，Fe3+添加后呈金黃，Cu2+添加后呈淺粉，其他離子添加與未酰化樣顏色一致。所有離子反應均產生絮狀物，吸光度值明顯高于未酰化樣品。

表2 金屬離子對花青素酰化前后溶液顏色的影響Table 2 Effect of metal ions on the solution color of anthocyanins before and after acylation

產生這樣的原因是由于花青素本身含有多個酚羥基，易與金屬離子絡合，影響顯色基團，產生不同程度的顏色變化。酰化后的花青素產生絮狀物的原因，可能是因為酰化后與金屬離子反應生成不溶性螯合物，這些螯合物或多或少影響了吸光度值的變化。總體來看花青素的穩定性都遭到了破壞。

Fe3+和Cu2+對無論酰化與否的花青素溶液結構狀態都產生了不同程度的影響，但是對比反應后的顏色可知，酰化后的花青素顏色更深，特別是對于Cu2+的添加，反應物呈淺粉色，而未酰化產物為無色，這說明酰化花青素抗Cu2+能力增加，色素保存率提高，穩定性提高，這是酰化花青素優于未酰化花青素之處。

總的來看加入這7種金屬離子，大部分未使花青素的顏色發生，最大波長下的吸光度值酰化后的花青素明顯增加，但是有沉淀物生成，未酰化的花青素吸光度值減小，穩定性降低，因此對于K+、Na+、Ca2+、Mg2+、Fe2+、Fe3+、Cu2+這些金屬離子，花青素在應用過程中（加工、保存及運輸）應避免與其接觸。對于Fe3+、Cu2+這2種金屬離子，酰化花青素色素保存率相對提高，穩定性增加，如果解決反應物沉淀問題，將有更強的研究意義。

3 結論

試驗采用分光光度法對篤斯越橘花青素的穩定性進行了分析研究。研究表明光照、溫度、氧化劑和還原劑、金屬離子等因素與花青素穩定性密切相關。

花青素的酰化提高了其耐溫性、耐光性和各種環境里的抗色素分解能力。

花青素的穩定性在一定范圍內與時間長短、溫度高低呈反相關，酰化花青素在同樣時間和同樣溫度下，穩定性高于未酰化花青素。當溫度高于60℃以后，花青素吸光度值大幅度下降，與酰化樣品吸光度值差別顯著，即未酰化樣品耐溫性顯著低于酰化樣品，說明酰化使得其耐溫性能有了很大的改良，對于工業生產過程中的高溫具有一定程度的耐受性。

避光可以降低色素分解，持續燈光比自然光對花青素分解的影響較大，酰化花青素在同樣光的環境中其穩定性高于未酰化花青素。

酰化花青素對氧化劑適應性強，有著很好的抗氧化能力，對于提高花青素的穩定性有積極作用，對還原劑的耐性一般，儲存或應用應避免與還原劑接觸。酰化后花青素與金屬離子反應會生成絮狀物或沉淀，其性質有待深入研究。

試驗證明酰化提高了花青素的穩定性，其酰化物的穩定性比未酰化物明顯優勢；花青素物質應該低溫避光保存；Fe2+、Fe3+和Cu2+對無論酰化與否的花青素都會產生不同程度的不利影響，在色素應用過程中（加工、保存及運輸）應避免與其接觸，其機理及其應用技術還需進一步研究。

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Q946.5

0254-5071（2017）05-0136-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.05.029

2016-12-01

“十三五”國家重點研發項目（2016YFC0500300）；黑龍江省科學院青年創新項目（ZLY2016-1）

朱良玉（1984-），女，助理研究員，博士研究生，研究方向為天然產物化學。

*通訊作者：沈光（1977-），男，副研究員，博士研究生，研究方向為經濟植物。