杏鮑菇多糖的酶法提取及其保濕和抗氧化活性評價

吳龍月，陳瑤，向福，2*，付自建，王普健，何峰，2

（1.黃岡師范學院生命科學學院，湖北黃岡438000；2.大別山特色資源開發湖北省協同創新中心，湖北黃岡438000）

杏鮑菇多糖的酶法提取及其保濕和抗氧化活性評價

吳龍月1，陳瑤1，向福1，2*，付自建1，王普健1，何峰1，2

（1.黃岡師范學院生命科學學院，湖北黃岡438000；2.大別山特色資源開發湖北省協同創新中心，湖北黃岡438000）

利用纖維素酶提取杏鮑菇中多糖，基于單因素和正交試驗優化提取工藝條件，并探討了多糖提取物的保濕性和抗氧化活性。結果表明，酶法提取的最佳工藝條件為纖維素酶用量0.7%，料液比1∶15（g∶mL），酶解溫度50℃，酶解時間120 min。在此條件下，杏鮑菇多糖的提取率為2.42%。同時，1%杏鮑菇多糖的保濕性在2 h內優于5%甘油，總抗氧化能力相當于VC的90.8%～96.7%，對羥基自由基清除能力可達到VC的82.2%，表明所提取的杏鮑菇多糖具有良好的保濕性和抗氧化活性。

杏鮑菇多糖；酶法提取；保濕性；抗氧化活性；羥基自由基清除能力

WU Longyue1,CHEN Yao1,XIANG Fu1,2*,FU Zijian1,WANG Pujian1,HE Feng1,2
(1.College of Life Sciences,Huanggang Normal University,Huanggang 438000,China; 2.Hubei Collaborative Innovation Center for the Characteristic Resources Exploitation of Dabie Mountains,Huanggang 438000,China)

杏鮑菇（Pleurotus eryngii）為側耳科側耳屬食用菌，也叫刺芹側耳，集食用、食療、藥用于一體，營養豐富，具有鮑魚和杏仁香味，被譽為“平菇王”、“草原上的美味牛肝菌”[1]。杏鮑菇含有豐富的真菌多糖，是其主要活性成分[2]。現代研究表明，杏鮑菇多糖及其衍生物不僅具有抑菌、抗病毒、抗腫瘤、抗氧化、清除自由基等活性[2-7]，同時還能增強免疫、調理腸胃以及防止動脈硬化[8-10]，甚至還具有保濕功效[11]，在醫藥食品、化妝美容等領域利用價值高，開發前景廣。

常用多糖提取方法（如水提、堿提、酸提、醇提等）存在提取率低、耗時長或者易引起多糖降解、影響生物活性等問題[2，11]。酶能溫和高效地降解生物大分子，酶法提取有利于杏鮑菇多糖活性成分的溶出，不破壞生物活性，且副產物少，實用安全。

近年來，從天然物質資源中獲取兼具保濕和營養雙重功能的天然保濕劑已逐漸引起人們的關注[11]。天然真菌多糖作為重要的保濕材料，研究其高效安全的提取工藝和抗氧化、保濕等功效活性，對科學利用杏鮑菇資源、深入開發高附加值產品具有現實意義和應用前景。

本研究采用酶法提取杏鮑菇多糖，通過單因素和正交設計試驗優化提取工藝條件，并以維生素C（vitaminC，VC）為對照[12]，評價其總抗氧化活性和羥基自由基清除能力；以甘油為對照[11]，評價杏鮑菇多糖的保濕性能，以期為杏鮑菇在化妝美容領域的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

杏鮑菇子實體：市售，烘干，粉碎備用；葡萄糖標準品（分析純）：上海金橞生物科技有限公司；維生素C標準品（純度≥99.99%）：上海麥克林生化科技有限公司；苯酚（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；甘油（分析純）：天津市天力化學試劑有限公司；乙醇（分析純）：上海山浦化工有限公司；氯仿（分析純）：天津市凱通化學試劑有限公司；正丁醇（分析純）：天津市大茂化學試劑廠；酸性纖維素酶（20 000 U/g）：湖北帝鑫化工制造有限公司；總抗氧化試劑盒（批號20161117）、羥基自由基試劑盒（批號20161121）：南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設備

Varian Cary 100 Scan型紫外可見分光光度計：美國Varian公司；Ax-205METTLERTOLEDO型電子天平：瑞士梅特勒-托利多集團；DZKW-D-2型電熱恒溫水浴鍋：北京西城區醫療器械廠；GL-21M型醫用離心機：湖南平凡科技有限公司；GZX-9240MBE恒溫干燥箱：上海博訊實業有限公司醫療設備廠；THZ-C型恒溫振蕩器：太倉市實驗設備廠。

1.3 實驗方法

1.3.1 葡萄糖標準曲線制備

根據參考文獻[13-14]所述方法，精密稱取10.00 mg葡萄糖標準品，加超純水定容至100 mL，配制成0.1 mg/mL的葡萄糖標準品母液。精密吸取標準品母液0、0.5mL、1.0mL、1.5mL、2.0mL、2.5mL、3.0mL、3.5mL、4.0mL、4.5mL、5.0mL分別置于10 mL容量瓶，加超純水定容，配制成質量濃度為0、5 μg/mL、10 μg/mL、15 μg/mL、20 μg/mL、25 μg/mL、30 μg/mL、35 μg/mL、40 μg/mL、45 μg/mL、50 μg/mL的葡萄糖標準溶液。準確吸取標準溶液2.0 mL于試管，先后加入5%苯酚溶液1 mL和濃硫酸5 mL，靜置10 min后于常溫下振蕩10～20 min，靜置2～3 h，以不加標準品溶液的試劑為空白，在波長490 nm處測定吸光度值。以葡萄糖質量濃度（C）為橫坐標，吸光度值（A）為縱坐標，繪制葡萄糖標準曲線，得到標準回歸方程為：A=0.015 6C+0.000 8，R2=0.999 5，表明葡萄糖質量濃度在5～50 μg/mL范圍內與吸光度值線性關系良好。

1.3.2 單因素試驗

平行稱取3份杏鮑菇粉末10 g分別置于錐形瓶中，加入適量的纖維素酶，按照一定的料液比（g∶mL）加入不同體積的水，攪拌均勻，置于恒溫振蕩箱中酶解一段時間后放入沸水水浴鍋中滅酶15 min，然后冷卻到50～60℃左右抽濾，制得粗多糖溶液。采用Sevage法[15]對制得粗多糖溶液進行脫蛋白，取100 mL粗多糖溶液加入離心管中，并加入等體積的4∶1（V∶V）的氯仿和正丁醇，充分搖勻后以10 000 r/min轉速離心10 min，取上清，去脂去蛋白兩次，合并上清液。在上清液中加入4倍體積的無水乙醇沉淀，常溫醇沉20 min，10 000 r/min離心10 min，取沉淀得多糖樣品[11]。考察纖維素酶用量（0.5%、0.6%、0.7%、0.8%）、酶解時間（100 min、110 min、120 min、130 min）、料液比（1∶10、1∶15、1∶20、1∶25（g∶mL））、酶解溫度（40℃、50℃、60℃、70℃）對杏鮑菇多糖提取率的影響。

1.3.3 杏鮑菇多糖換算因子測定及提取率的計算

根據文獻方法[15]，多糖樣品在60℃干燥至質量恒定，準確稱取10 mg，加適量水溶解后轉移至100 mL容量瓶中定容，制得多糖儲備液。精確吸取多糖儲備液2.0 mL，按1.3.1方法處理后在波長490 nm處測吸光度值，由葡萄糖標準曲線回歸方程計算多糖儲備液中葡萄糖的質量濃度（ρ0），換算因子計算公式如下：

式中：f為換算因子；m0為多糖質量，μg；ρ0為多糖儲備液中葡萄糖的質量濃度，μg/mL；V0為多糖儲備液體積，mL；D0為多糖的稀釋倍數。試驗測得換算因子f=3.36。

將多糖樣品用20 mL去離子水溶解，稀釋250倍后再吸取2.0 mL，按1.3.1方法處理后在波長490 nm處測吸光度值，根據葡萄糖標準曲線回歸方程計算其葡萄糖的質量濃度，多糖提取率計算公式如下：

式中：Y為多糖提取率，%；ρ為多糖樣品液中葡萄糖的質量濃度，μg/mL；V為多糖樣品液體積，mL；D為樣品液的稀釋倍數；f為換算因子，3.36；m為杏鮑菇樣品的質量，μg。

1.3.4 正交設計試驗

基于單因素試驗結果，選取對杏鮑菇多糖提取率影響較顯著的酶解時間、料液比和酶解溫度3因素，進行正交試驗設計優化多糖提取工藝條件，正交試驗因素與水平如表1所示。

表1 多糖提取工藝優化正交試驗優化因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for polysaccharides extraction process optimization

1.3.5 保濕性能評價[11]

以甘油和去離子水為參照，采用體外法評價杏鮑菇多糖粗提物的保濕性能。將杏鮑菇多糖提取物和甘油分別配成1%和5%的水溶液，選用76 mm×26 mm相同規格的載玻片3片，分別在載玻片表面貼一層醫用透氣膠帶，準確吸取杏鮑菇多糖溶液、甘油溶液、去離子水各200 μL，分別點樣在透氣膠帶上，稱取初始質量，然后在室溫下放置一定時間（30 min、60 min、90 min、120 min）后稱質量，失水率越低，則保濕性能越好。失水率計算公式如下：

式中：L為失水率，%；M0為初始質量，g；Mt為一定時間后的載玻片質量，g；t為放置時間，min。

1.3.6 總抗氧化能力評價

分別配制質量濃度為10 g/L、20 g/L、30 g/L、40 g/L的杏鮑菇多糖溶液，并以相同質量濃度的VC作為陽性對照，根據總抗氧化試劑盒說明書操作后，將測試管、對照管樣液在波長520 nm處測定吸光度值。在37℃條件下，每毫升樣品每分鐘使反應體系的吸光度值每增加0.01時，定義為一個總抗氧化能力單位（U），則總抗氧化能力計算公式如下：

式中：T為總抗氧能力，U/mL；As為測定管吸光度值；Ac為對照管吸光度值；Vt為反應液總體積，mL；Vs為取樣量，mL；n為樣品測試前稀釋倍數。

1.3.7 羥基自由基清除能力評價

分別配制質量濃度為10 g/L、20 g/L、30 g/L、40 g/L、50 g/L、60 g/L的杏鮑菇多糖溶液，并以相同質量濃度的VC作為陽性對照，根據羥基自由基試劑盒說明書操作后，將測定管、空白管、對照管樣液在波長536 nm處測定吸光度值。羥基自由基清除率計算公式如下：

式中：H為羥基自由基清除率，%；OD1為測定管吸光度值；OD2為對照管吸光度值；OD3為空白管吸光度值。

1.3.8 統計分析

利用正交設計助手II v3.1和EXCEL 2003軟件進行試驗設計和數據分析，通過F值分析顯著性。

2 結果與分析

2.1 單因素結果

2.1.1 纖維素酶用量對多糖提取率的影響

考察纖維素酶用量對杏鮑菇多糖提取率的影響，結果如圖1所示。

圖1 纖維素酶用量對杏鮑菇多糖提取率的影響Fig.1 Effect of cellulase addition on the extraction rate of P.eryngiipolysaccharide

由圖1可知，隨著纖維素酶量的增加，杏鮑菇多糖的提取率逐漸增大，當纖維素酶用量為0.7%時，杏鮑菇多糖提取率達到最高，為1.44%；繼續增加酶用量至0.8%，杏鮑菇多糖提取率稍有下降，為1.41%，與1.44%無顯著差異（P=0.54＞0.05），即繼續增加纖維素酶量，多糖提取率趨于穩定。這是由于酶量過多，酶分子已達飽和，與底物接觸過剩，降低了反應速率，減少了多糖溶出[16]。因此，纖維素酶用量宜選擇0.7%。

2.1.2 酶解時間對多糖提取率的影響

考察酶解時間對杏鮑菇多糖提取率的影響，結果如圖2所示。

圖2 酶解時間對杏鮑菇多糖提取率的影響Fig.2 Effect of hydrolysis time on the extraction rate of P.eryngiipolysaccharide

由圖2可知，當酶解時間從100 min增加到110 min，杏鮑菇多糖提取率顯著增加（P=0.04＜0.05），且當酶解時間為110 min時，杏鮑菇多糖提取率達到峰值，為1.07%；繼續延長酶解時間至120 min，提取率顯著降低（P=0.03＜0.05），延長至130 min時，提取率無顯著變化（P=0.68＞0.05），基本趨于穩定。酶解時間對杏鮑菇多糖的提取率影響顯著，因此，選擇酶解時間110 min為宜。

2.1.3 料液比對綠原酸提取率的影響

考察料液比對杏鮑菇多糖提取率的影響，結果如圖3所示。

圖3 料液比對杏鮑菇多糖提取率的影響Fig.3 Effect of the solid-liquid ratio on the extraction rate of P.eryngiipolysaccharide

由圖3可知，料液比對杏鮑菇多糖提取率影響顯著。料液比從1∶10（g∶mL）增加到1∶15（g∶mL）時，杏鮑菇多糖提取率增加到峰值，為1.27%，差異性顯著（P=0.02＜0.05）；隨著料液比增加至1∶20（g∶mL）時，多糖提取率下降至0.73%，差異極顯著（P=0.001＜0.01），下降趨勢明顯。因此，選擇料液比1∶15（g∶mL）為宜。

2.1.4 酶解溫度對杏鮑菇多糖提取率的影響

考察酶解溫度對杏鮑菇多糖提取率的影響，結果如圖4所示。

圖4 酶解溫度對杏鮑菇多糖提取率的影響Fig.4 Effect of hydrolysis temperature on the extraction rate of P.eryngiipolysaccharide

由圖4可知，酶解溫度＜60℃時，多糖提取率隨著溫度升高逐漸增加，當溫度升高到60℃時，杏鮑菇多糖提取率達到峰值，為1.30%，差異顯著（P=0.006＜0.01）；繼續升高酶解溫度到70℃，多糖提取率則顯著下降（P＜0.001）。這是由于纖維素酶在60℃達到最適酶解溫度，酶解活性最強，高于和低于該溫度其酶解活性降低，從而導致多糖提取率下降。因此，選擇酶解溫度60℃為宜。

2.2 正交試驗結果

表2 杏鮑菇多糖提取工藝優化正交試驗設計及結果Table 2 Design and results of orthogonal experiments for extraction process optimization ofP.eryngii polysaccharide

根據單因素試驗結果，固定纖維素酶用量為0.7%，以杏鮑菇多糖提取率（Y）為評價指標，選取酶解時間（A）、料液比（B）和酶解溫度（C）3個對杏鮑菇多糖提取率影響較顯著的因素為變量值，設計L9（33）正交優化試驗，試驗設計及結果見表2，方差分析結果見表3。

表3 正交試驗結果方差分析Table 3 Variance analysis for orthogonal experiments results

由表2和表3結果可知，各因素對杏鮑菇多糖提取率的影響次序為：C＞A＞B，即酶解溫度＞酶解時間＞料液比，但各因素的影響均不顯著。獲得最佳工藝條件為A3B2C1，即酶解時間120 min，料液比1∶15（g∶mL），酶解溫度50℃。該組合在表2的正交設計試驗中，多糖提取率最高，為2.42%。

2.3 保濕性評價

去離子水、1%杏鮑菇多糖溶液、5%甘油溶液在一定時間內的失水率變化情況如圖5所示。由圖5可知，隨著放置時間延長，3種樣品的失水率均呈總體下降趨勢。從30min到120 min，去離子水的失水率由24%降至9.6%，各時間段失水率降低極顯著（P＜0.001）；5%甘油溶液從30 min到90 min，失水率明顯降低（P＜0.05），從90 min到120 min則降低極顯著（P＜0.001）；1%杏鮑菇多糖溶液從30 min到90 min，失水率降低不明顯（P＞0.05），從90 min到120 min則顯著降低（P＜0.01）。在120 min內，盡管3種樣品的失水率曲線下降趨勢基本，但失水率最高的一直是去離子水樣品，其次是5%甘油溶液，1%杏鮑菇多糖溶液的失水率在每個檢測時間點均最低，表明在120 min內1%杏鮑菇多糖的保濕性優于5%甘油。這與張志軍等[11]的研究結果一致。

圖5 三種樣品的失水率Fig.5 Rate of water loss of three samples

2.4 抗氧化能力評價

以VC為陽性對照，測定質量濃度為10g/L、20g/L、30g/L、40 g/L杏鮑菇多糖樣品的總抗氧化能力，結果如圖6所示。

圖6 杏鮑菇多糖和VC的總抗氧化能力的比較Fig.6 Comparison of total antioxidant activity ofP.eryngii polysaccharide and VC

在圖6中的試驗濃度范圍內，不同質量濃度VC的總抗氧化能力無明顯差異（P＞0.05），基本穩定在99 U/mL左右；杏鮑菇多糖的總抗氧化能力則呈上升趨勢：在10 g/L質量濃度時最低，為VC的90.8%，40 g/L時總抗氧化能力最強，達到96.35U/mL，相當于VC的96.7%。表明杏鮑菇多糖具有一定的抗氧化能力，為相同質量濃度VC的90.8%～96.7%。

2.5 杏鮑菇多糖清除羥基自由基能力評價

羥基自由基是在新陳代謝過程中產生的活潑自由基，毒性很大，作用于體內酯類、核酸、蛋白質等生物大分子，損傷細胞結構和功能，導致體內代謝紊亂而引發各種疾病[17]。檢測質量濃度為10 g/L、20 g/L、30 g/L、40 g/L、50 g/L、60 g/L的杏鮑菇多糖和VC對羥基自由基清除能力，結果如圖7所示。

圖7 杏鮑菇多糖和和VC對羥基自由基清除能力的比較Fig.7 Comparison of hydroxyl radical scavenging activities of P.eryngiipolysaccharide and VC

由圖7可知，各質量濃度下，杏鮑菇多糖的羥基自由基清除率均低于VC，且羥基自由基清除率均隨著質量濃度的增加而升高，當質量濃度從30 g/L增加至40 g/L時，二者清除羥基自由基能力大幅增強；當質量濃度為60 g/L時，VC的羥基自由基清除率達到99.23%，杏鮑菇多糖則達到81.58%。表明杏鮑菇多糖具有一定的羥基自由基清除能力，可達到相同質量濃度VC的82.2%。

3 結論

本研究基于單因素和正交試驗，建立了酶法提取杏鮑菇中多糖的工藝。獲得杏鮑菇多糖提取的最佳工藝條件為：纖維素酶用量0.7%、酶解時間120 min、料液比1∶15（g∶mL）、酶解溫度50℃。在此條件下，多糖提取率為2.42%。在120min內，1%杏鮑菇多糖的保濕性優于5%的甘油；總抗氧化能力為相同質量濃度VC的90.8%～96.7%，表明所提取杏鮑菇多糖具有良好的保濕性和抗氧化能力；羥基自由基清除率達到相同質量濃度VC的82.2%，具有良好的羥基自由基清除能力。因此，杏鮑菇多糖可作為一種兼具保濕和抗氧化雙重功能的天然保濕劑，具有較好的應用前景。

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R284.2

0254-5071（2017）05-0161-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.05.034

2017-02-18

大學生創新培育項目（sgpx201601）

吳龍月（1995-），女，本科生，研究方向為天然產物提取。

*通訊作者：向福（1977-），男，教授，博士，研究方向為天然植物資源利用。