俄羅斯野生藍莓引種前后營養成分含量及抗氧化活性的比較分析

包怡紅，梁敏，趙行，常晨，徐福成

（1.東北林業大學林學院，黑龍江哈爾濱150040；2.黑河市中俄林業科技合作園區，黑龍江黑河164300）

俄羅斯野生藍莓引種前后營養成分含量及抗氧化活性的比較分析

包怡紅1，梁敏1，趙行1，常晨1，徐福成2

（1.東北林業大學林學院，黑龍江哈爾濱150040；2.黑河市中俄林業科技合作園區，黑龍江黑河164300）

為了研究引種栽培對于野生藍莓營養成分及抗氧化活性的影響，選取俄羅斯阿穆爾州騰達市的野生藍莓（藍莓RU）和將該種野生藍莓經引種栽培讓其自然生長于中國黑河市二站鄉的野生藍莓（藍莓HH）為原料，采用福林酚法、pH示差法、亞硝酸鈉-硝酸銀比色法和電感耦合等離子體-質譜法（ICP-MS）等方法分析比較了兩種藍莓的活性成分（多酚、花色苷、黃酮）、礦物質元素和糖酸含量，并對水提物和醇提物的抗氧化能力進行了比較。結果表明，藍莓RU的可溶性固形物、還原糖、多酚含量高于藍莓HH，但總酸、花色苷、黃酮含量低于藍莓HH。二者的Ca、Mn、P、Zn、Cr元素含量存在顯著差異（P＜0.05），其他的礦物質元素差異不顯著（P＞0.05）。藍莓RU水提物與醇提物的DPPH自由基清除率和Fe3+還原力高于藍莓HH，但藍莓HH的羥基自由基的清除率高于藍莓RU。

野生藍莓；引種前后；主要成分；抗氧化活性

BAO Yihong1,LIANG Min1,ZHAO Hang1,CHANG Chen1,XU Fucheng2
(1.School of Forestry,Northeast Forestry University,Harbin 150040,China;2.Forestry Science and Technology Cooperation Park Between China and Russia in Heihe City,Heihe 164300,China)

藍莓又稱藍漿果、越橘，杜鵑花科越橘屬植物，為多年生落葉或常綠灌木。藍莓果實形狀近似圓形，顏色呈藍色，外被一層白色果粉[1-2]。藍莓分布于北半球的亞熱帶和溫帶，全世界約有400種[3]。其不僅含有有機酸、糖類、多種礦物質元素、維生素，還含有多種活性成分（如多酚、花青素、黃酮等），因此藍莓除了可以鮮食外，還可應用于制藥和化妝品行業[1，4]。研究表明，藍莓具有抗氧化[5]、抑菌[6]、減輕輻射誘發的肺傷害[7]、抑制癌細胞的生長和繁殖、改變酶活、調節基因的表達[8-9]、抗衰老[10]、增強人體免疫力[11]、保護視力[12]等作用。

目前，研究者對藍莓活性成分的提取及功能活性進行了較多的研究。如孟憲軍等[13]提取藍莓多糖，發現其具有較強的抗氧化性。CHORFAN等[14]采用硅膠和C-18和DSC-SCX陽離子交換樹脂對野生藍莓的花青素進行固相萃取得到高純度花青素，并進行自由基清除能力的研究。美國塔夫茨大學的研究人員[15]曾對60種不同果蔬的抗氧化能力進行了比較分析，結果表明，藍莓的抗氧化能力位列前茅。

有醫學研究表明[16]，一些重大疾病（如腫瘤、癌癥、動脈粥樣硬化、糖尿病以及衰老等）均是由自由基氧化損傷所致，因此抗氧化活性具有很重要的研究意義。雖然近年來，廣大研究者對藍莓及其抗氧化性進行了大量研究，但是，同種藍莓引種栽培前后于不同生長條件下的藍莓之間成分及抗氧化活性的差異鮮有研究。本試驗選取俄羅斯阿穆爾州騰達市的野生藍莓（藍莓RU）和將該野生藍莓引種栽培于中國黑河二站鄉的藍莓（藍莓HH）為原料，分析比較了二者的主要成分，水提物和醇提物的抗氧化活性，為藍莓的引種栽培以及產品開發和利用提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

俄羅斯野生藍莓（藍莓RU）產于俄羅斯阿穆爾州騰達市（東經124°43′，北緯55°09′）；中國黑河二站鄉藍莓（藍莓HH）引種栽培于黑河市二站鄉（東經126°58′，北緯49°40′）并自然生長；福林酚、苯酚、蘆丁、沒食子酸（純度≥98%）、鐵氰化鉀、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、三氯化鐵、硫酸亞鐵、硝酸銀等均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

NexION 300X電感耦合等離子體-質譜儀（Inductively coupledplasma-massspectrometry，ICP-MS）：鉑金埃爾默企業管理有限公司；722型可見分光光度計：上海光譜儀器有限公司；VBR20手持式折光儀：上海醫聯控溫儀器廠；EL20實驗室pH計：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；KQ-500DE數控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；天量系列LT1002E電子天平：常熟市天量儀器有限責任公司。

1.3 方法

1.3.1 藍莓的預處理

挑選成熟度一致且無機械損傷和病蟲害的藍莓，凍存于-20℃的冰箱內，備用。

1.3.2 活性成分的提取

（1）花色苷提取液的制備

將藍莓用研缽研磨破碎，按料液比1∶15（g∶mL）加入提取劑（體積分數70%乙醇溶液+0.1%濃鹽酸），于60℃條件下水浴避光提取90 min，抽濾、濃縮得到花色苷提取液。

（2）黃酮提取液的制備

磨碎的藍莓按料液比1∶15（g∶mL）加入體積分數65%乙醇溶液，60℃水浴提取2 h，抽濾，濃縮得到黃酮提取液。

（3）多酚提取液的制備

磨碎的藍莓按料液比1∶25（g∶mL）加體積分數50%乙醇溶液，于40℃、超聲功率為500W的條件下超聲提取90min。經抽濾、濃縮得到多酚提取液。

1.3.3 測定方法

（1）糖酸指標

可溶性固形物：手持式折光儀[17]；pH值：pH計[17]；還原糖含量：參照GB/T 5009.7—2008《食品中還原糖的測定》的方法；總酸含量：參照GB/T 12456—2008《食品中總酸的測定》的方法；

（2）礦物質元素含量

參照陸美斌等[18]的方法采用電感耦合等離子體-質譜法，并在其基礎上進行適當調整。具體方法：精確定量稱取藍莓果汁0.5g（精確到0.0001g）左右，置于聚四氟乙烯微波消解管中，加8 mL硝酸浸泡過夜，再加3 mL過氧化氫按微波程序消解，待消解完全后，冷卻，在趕酸儀120℃條件下揮酸3 h，用超純水轉移定容至25 mL，同時進行空白試驗。

（3）活性成分

花色苷含量：參照DENEV P等[19]采用pH示差法。

黃酮含量：采用亞硝酸鈉-硝酸銀比色法[20]。以蘆丁為標準品，將不同質量濃度的蘆丁在波長510 nm處測定吸光度值。以蘆丁的質量濃度（x）為橫坐標，以吸光度值（y）為縱坐標，繪制的標準曲線：y=1.479 1x+0.013 05，R2=0.999 1。利用標準曲線計算樣品中黃酮含量。

多酚含量：采用福林酚法[21]。以沒食子酸為標準品，以蒸餾水為空白，于波長765 nm處測定吸光度值。以沒食子酸質量濃度（x）為橫坐標，吸光度值（y）為縱坐標，繪制沒食子酸標準曲線：y=2.065 9x+0.031 37，R2=0.999 1。根據標準曲線回歸方程計算樣品中多酚的含量。

1.3.4 藍莓水提物和醇提物抗氧化測定

（1）藍莓水提物的制備

磨碎的藍莓按料液比1∶20（g∶mL）加蒸餾水，80℃水浴提取2 h。抽濾得到濾液，為藍莓水提物。

（2）藍莓醇提物的制備

磨碎的藍莓按料液比1∶20（g∶mL）加入體積分數60%乙醇溶液，50℃水浴提取2h。抽濾得到濾液，為藍莓醇提物。

（3）DPPH自由基清除率的測定

取2mL不同質量濃度的藍莓溶液加入2mL0.2mmol/L DPPH溶液，以溶劑為對照，立即搖勻，在室溫條件下置于暗處30 min，在波長517 nm處測定吸光度值。取不同質量濃度的藍莓提取液2 mL，與2 mL溶劑混合在波長517 nm處測吸光度值。取2 mL DPPH與2 mL溶劑混合在波長517nm處測吸光度值[22]。每個樣品做3個平行，取平均值。根據下列公式進行DPPH自由基清除率計算：

式中：A0為2mL DPPH與2 mL溶劑的吸光度值；A1為2 mL不同濃度藍莓溶液與2 mL DPPH混合溶液的吸光度值；A2為2mL不同濃度的藍莓溶液與2mL溶劑的吸光度值。

（4）羥基自由基清除率的測定

參照孟阿會[23]的方法并作一些調整。在試管內分別加入1 mL水楊酸乙醇溶液、1 mL FeSO4溶液、不同樣品質量濃度的藍莓提取液7 mL，加入1 mL H2O2啟動反應。振蕩搖勻，于37℃水浴鍋中反應30 min，在波長510nm處測吸光度值，以蒸餾水代替雙氧水作對照，以溶劑代替藍莓提取液作空白組。每個樣品做3個平行，取平均值。根據下列公式進行羥基自由基清除率計算：

式中：A0為溶劑替代藍莓提取液的吸光度值；Ai0為蒸餾水替代雙氧水的吸光度值；Ai為不同濃度藍莓提取液的吸光度值。

（5）鐵離子還原力的測定

取2.5 mL不同樣品質量濃度的藍莓提取液，加2.0 mL磷酸緩沖液（pH6.6）和2.5 mL1%的鐵氰化鉀，50℃水浴30 min，反應結束迅速冷卻，加入2.5 mL 10%的三氯乙酸溶液，離心，取上清液2.5 mL，加入2.5 mL水和0.5 mL 0.1%的FeCl3溶液，混勻，靜置10 min，于波長700 nm處測定吸光度值。重復3次，取平均值[24]。

2 結果與分析

2.1 兩地野生藍莓營養成分比較

生長于不同環境的兩種自然生長的藍莓：藍莓RU和藍莓HH，盡管外觀沒有明顯區別，但成分含量卻有所差別，具體結果見表1和表2。

表1 兩種藍莓中糖酸指標Table 1 Sugar and acid indexes of two kinds of blueberry

由表1可知，藍莓RU的pH值、還原糖含量和可溶性固形物高于藍莓HH，而總酸含量低于藍莓HH。經統計分析可知，兩種藍莓的4種成分含量差異性顯著（P＜0.05），尤其是還原糖含量，二者相差較多，這可能是由于阿穆爾州騰達市的緯度高于黑河，使得藍莓RU所接受的日照時間要長于藍莓HH，從而導致藍莓RU進行的光合作用時間長，而呼吸作用時間較短，積累了更多的糖類化合物。

表2 兩種藍莓中礦物質元素的含量比較Table 2 Comparison of mineral elements content in two kinds of blueberrymg/kg

由表2可知，兩種藍莓均含有豐富的礦物質元素，其中K含量最高，其次是Ca、Mg、P，此外，還含有Fe、Zn等人體所需的礦物質元素。經統計分析表明兩種藍莓中礦物質元素Ca、P、Zn、Mn、Cr的含量存在顯著性差異，而K、Mg、Fe、Cu、Co無顯著性差異。這可能由于兩個地方的土壤條件對藍莓中礦物元素的形成起到了主導因素。

2.2 活性成分的含量

研究表明藍莓中存在著多種活性成分。本試驗的不同產地的兩種藍莓中活性成分（多酚、黃酮、花色苷）的含量如圖1所示。

圖1 兩種藍莓中活性成分含量比較Fig.1 Comparison of active components contents of two kinds of blueberry

由圖1可以看出，兩種藍莓的三種活性成分存在一定程度的差異。其中，藍莓HH的花色苷和黃酮含量高于藍莓RU，而多酚含量低于藍莓RU，通過顯著性分析，結果顯示這三種活性成分含量存在顯著性差異（P＜0.05）。這可能是由于這兩種野生藍莓的生長環境，如光照、濕度等均會影響野生藍莓成熟期間花色苷、黃酮和多酚在果內的累積。

2.3 水提物抗氧化活性

2.3.1 清除DPPH自由基能力

以蒸餾水為溶劑代替水提藍莓溶液作空白對照，采用1.3.4中DPPH自由基清除率的測定方法對兩種藍莓水提物的DPPH自由基清除能力進行測定，結果見圖2。

圖2 兩種藍莓水提物對DPPH自由基的清除作用Fig.2 Scavenging effect of aqueous extracts from two kinds of blueberry on DPPH free radicals

由圖2可知，藍莓RU的DPPH自由基清除率要高于藍莓HH。在樣品濃度增加的過程中，兩種果的清除能力都在逐漸上升，但藍莓RU清除能力上升的速度更快。在樣品質量濃度為5 mg/mL時，藍莓RU和藍莓HH的DPPH自由基清除率分別為93.22%、75.48%，二者相差較多。這可能是因為藍莓RU中的多糖含量高于藍莓HH。大量研究已經表明，植物多糖具有一定的抗氧化活性。

2.3.2 清除羥基自由基能力

以蒸餾水為溶劑代替藍莓提取液作空白對照。兩種藍莓水提物對羥基自由基的清除率見圖3。

圖3 兩種藍莓水提物對·OH的清除作用Fig.3 Scavenging effect of aqueous extracts from two kinds of blueberry on·OH

由圖3可知，藍莓HH的羥基自由基清除率要高于藍莓RU。在樣品濃度增加的過程中，兩種果的清除能力都在逐漸上升，且二者上升速度基本保持平行。在樣品質量濃度為5 mg/mL時，藍莓RU和藍莓HH的羥基自由基清除率分別為42.62%和48.24%，相對于DPPH自由基而言，兩種藍莓的羥基自由基清除能力偏低。

2.3.3 Fe3+還原力的測定

兩種藍莓水提物對Fe3+還原力見圖4。

圖4 兩種藍莓水提物對Fe3+還原能力Fig.4 Reducing capacity effect of aqueous extracts from two kinds of blueberry on Fe3+

由圖4可知，藍莓RU對Fe3+還原力高于藍莓HH，在1～5 mg/mL范圍內，隨樣品濃度的增加，吸光度值隨著增加，但藍莓RU增加速度較快，且在樣品質量濃度由4mg/mL變為5 mg/mL時，吸光度值明顯增加。

2.4 醇提物抗氧化活性

2.4.1 DPPH自由基清除能力

以乙醇為溶劑代替醇提藍莓溶液作為空白對照，采用1.3.4中DPPH自由基清除率的方法，測定與水提物同濃度的藍莓醇提物濃度的清除能力進行測定，結果見圖5。

圖5 兩種藍莓醇提物對DPPH自由基的清除作用Fig.5 Scavenging effect of alcohol extracts from two kinds of blueberry on DPPH free radicals

由圖5可知，藍莓RU的DPPH自由基清除率要高于藍莓HH，二者的清除率隨樣品濃度的增加而增大，且增加程度基本保持平行，在樣品質量濃度為5 mg/mL時，二者的清除率分別為91.44%和87.07%。出現這種現象的原因可能是由于藍莓RU中多酚含量較高。

2.4.2 羥基自由基清除能力

以乙醇為溶劑代替藍莓醇提液作空白對照，兩種藍莓醇提物對羥基自由基的清除能力見圖6。

圖6 兩種藍莓醇提物對·OH的清除作用Fig.6 Scavenging effect of alcohol extracts from two kinds of blueberry on·OH

由圖6可知，藍莓HH的羥基自由基清除率要高于藍莓RU，在樣品質量濃度為1～5 mg/mL的范圍內，樣品對羥基自由基的清除率逐漸增大，在樣品質量濃度為5 mg/mL時，分別為47.80%和38.26%。相對于醇提物對DPPH自由基清除率，醇提物對羥基自由基的清除率偏低。

2.4.3 Fe3+還原能力的測定

兩種藍莓醇提物對Fe3+的還原力見圖7。

圖7 兩種藍莓醇提物對Fe3+還原能力Fig.7 Reducing effect of alcohol extract from two kinds of blueberry on Fe3+

由圖7可知，藍莓RU的Fe3+還原力的要高于藍莓HH，在樣品質量濃度為1～5 mg/mL的范圍內，樣品的Fe3+還原力逐漸升高，兩種藍莓醇提物對Fe3+的還原力相差較小。

野生藍莓水提物中的主要成分是藍莓多糖，醇提物中主要是酚類化合物。通過比較同種藍莓引種前后的兩種野生藍莓水提物和醇提物的抗氧化性發現二者均具有一定的抗氧化活性，在樣品質量濃度為5 mg/mL時，藍莓RU水提物和醇提物DPPH自由基清除率分別為93.22%和91.44%，藍莓HH分別為75.48%和87.07%。此外，水提物和醇提物還具有較強的鐵離子還原力，但是對羥基自由基的清除能力較低。

3 結論

本試驗對藍莓HH與藍莓RU中主要活性成分、礦物質元素和糖酸指標的含量、水提物與醇提物的抗氧化活性進行了分析。結果表明，藍莓RU的可溶性固形物、還原糖、多酚含量高于藍莓HH，但是總酸、花色苷、黃酮含量低于藍莓HH。酸、還原糖及活性成分的差異可能是由于所處地方日照時間、年積溫等不同造成的。對于礦物質元素，顯著性分析表明：兩種藍莓中礦物質元素Ca、P、Zn、Mn、Cr、的含量存在顯著性差異，而K、Mg、Fe、Cu、Co無顯著性差異，這可能是因為兩地的土壤條件及周邊環境的不同。抗氧化研究表明，藍莓RU水提物與醇提物的DPPH自由基清除率和Fe3+還原力要強于藍莓HH，而藍莓HH的羥基自由基的清除率要強于藍莓RU。通過比較發現引種前后兩種自然生長的藍莓在營養成分方面各有千秋，且二者都具有較強的抗氧化性，這表明不同的經緯度和自然環境條件會對藍莓的成分產生一定的影響。

[1]李金星，胡志和.藍莓花青素的研究進展[J].核農學報，2013，27（6）：817-822.

[2]陳燕，孫曉紅，曹奕，等.藍莓抑菌活性研究進展[J].天然產物研究與開發，2013，25（5）：716-721.

[3]方仲相，胡君艷，江波，等.藍莓研究進展[J].浙江農林大學學報，2013，30（4）：599-606.

[4]BIZABANI C,FONTENLA S,DAMES J F.Ericoid fungal inoculation of blueberry under commercial production in South Africa[J].Sci Hortic, 2016,209:173-177.

[5]PERTUZATTI P B,BARCIA M T,RODRIGUES D,et al.Antioxidant activity of hydrophilic and lipophilic extracts of Brazilian blueberries[J]. Food Chem,2014,164:81-88.

[6]CHATTERJEE A,YASMIN T,BAGCHI D,et al.Inhibition of Helicobacter pyloriin vitroby various berry extracts,with enhanced susceptibilityto clari&thromycin[J].Mol Cell Biochem,2004,265(1-2):19-26. [7]LIU Y N,TAN D,TONG C C,et al.Blueberry anthocyanins ameliorate radiation-induced lung injury through the protein kinase RNA-activated pathway[J].Chem-Biol Interact,2015,242:363-371.

[8]LINK A,BALAQUER F,GOEL A.Cancer chemoprevention by dietary polyphenols:promising role for epigenetics[J].Biochem Pharmacol, 2010,80(12):1771-1792.

[9]SPAGNUOLO C,RUSSO M,BILOTTO,et al.Dietary polyphenols in cancer prevention:the example of the flavonoid quercetin in leukemia[J]. Ann New York Acad Sci,2012,1259:95-103.

[10]邵盈盈.藍莓總黃酮的提取純化及紫心甘薯總黃酮的抗衰老作用評價[D].杭州：浙江大學，2013.

[11]嚴婷，李世芬，趙巖.藍莓對小鼠免疫功能的調節作用[J].南京醫科大學學報，2008，28（11）：45-48.

[12]李森，莫依燦.藍莓飲料研究概況[J].中國釀造，2016，35（7）：11-14.

[13]孟憲軍，孫希云，朱金艷，等.藍莓多糖的優化提取及抗氧化性研究[J].食品與生物技術學報，2010，29（1）：56-60.

[14]CHORFA N,SAVARD S,BELKACEMI K.An efficient method for high-purity anthocyanin isomers isolation from wild blueberries and their radical scavenging activity[J].Food Chem,2016,197:1226-1234.

[15]KALT W,DUFOUR D.Health functionality of blueberries[J].Hort Technol,1997,7(3):216-221.

[16]姜文潔.不同栽培藍莓品種抗氧化與抑菌功能的研究[D].上海：上海海洋大學，2015.

[17]王芳.藍霉果酒釀造工芝及對其品質影響的硏究[D].哈爾濱：東北林業大學，2015.

[18]陸美斌，王步軍，李靜梅，等.電感耦合等離子體質譜法測定谷物中重金屬含量的方法研究[J].光譜學與光譜分析，2012，32（8）：2234-2237.

[19]DENEV P,KRATCHANOVA M,CIZ M,et al.Biological activities of selected polyphenol-rich fruits related to immunity and gastrointestinal health[J]. Food Chem,2014,157:37-44.

[20]侯學敏，李林霞，張直峰，等.響應面法優化薄荷葉總黃酮提取工藝及抗氧化活性[J].食品科學，2013，34（6）：124-128.

[21]WANG Y H,ZHU J Y,MENG X J,et al.Comparison of polyphenol, anthocyanin and antioxidant capacity in four varieties ofLonicera caeruleaberry extracts[J].Food Chem,2016,197:522-529.

[22]楊玲.藍靛果提取物抗氧化及抗癌作用的研究[D].哈爾濱：東北林業大學，2009.

[23]孟阿會.核桃油成分及抗氧化性質研究[D].北京：北京林業大學，2012.

[24]胡衛成，王新風，沈婷，等.響應面試驗優化蓮蓬殼總黃酮超聲提取條件及其抗氧化活性[J].食品科學，2015，36（24）：51-56.

TS255.1

0254-5071（2017）05-0156-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.05.033

2017-01-09

中央高校項目專項基金（2572014EA02）；哈爾濱市科技創新人才項目（2015RAXXJ010）

包怡紅（1970-），女，教授，博士，研究方向為林下資源精深加工，功能性食品。