高脂飲食HFA-小鼠腸道菌群結構和NF-κB炎癥通路研究

高潔，孫靜，黃建，龔凌霄，霍軍生*

（1.中國疾病預防控制中心營養與健康所，北京100050；2.國家衛生計生委微量元素營養重點實驗室，北京100050；3.北京工商大學食品學院，北京100048）

高脂飲食HFA-小鼠腸道菌群結構和NF-κB炎癥通路研究

高潔1，2，孫靜1，2，黃建1，2，龔凌霄3，霍軍生1，2*

（1.中國疾病預防控制中心營養與健康所，北京100050；2.國家衛生計生委微量元素營養重點實驗室，北京100050；3.北京工商大學食品學院，北京100048）

通過胖瘦HFA-小鼠模型研究腸道菌群結構在高脂飲食下的變化及宿主炎癥反應。實驗前后高通量測序結果顯示，1組小鼠優勢菌相擬桿菌屬（Bacteroides）的組成比例由61.9%降低為40.5%；非優勢菌相中Akkermansia、Blautia、Dorea、埃希氏菌屬（Escherichia）及Turicibacter5個菌屬分別增加為原來的70.4、3.9、13.3、4.5和311倍；Alistipes和乳桿菌屬（Lactobacillus）2個菌屬減少為原來的1/10和1/5；2組小鼠腸道菌群擬桿菌屬（Bacteroides）由31.2%增加為39.4%，Parabacteroides由18.9%降低為8.4%。逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）結果顯示，各組小鼠炎癥因子水平無差異（P＞0.05），而第1組的相關調控基因NF-κB和PPARγ的表達量顯著高于第2組（P＜0.05）。因此推斷，在屬水平上，“胖菌群”HFA-小鼠腸道菌群容易受到高脂飲食的改變，“瘦菌群”HFA-小鼠腸道菌群結構相對穩定；腸道菌群可能通過影響PPARγ和NF-κB兩個基因的表達而引起炎癥反應。

高脂飲食；人源腸道菌群小鼠；炎癥因子；基因NF-κB；基因PPARγ

GAO Jie1,2,SUN Jing1,2,HUANG Jian1,2,GONG Lingxiao3,HUO Junsheng1,2*
(1.National Institute for Nutrition and Health,Chinese Center for Disease Control and Prevention,Beijing 100050,China; 2.Key Lab of National Health and Family Planning Commission for Microelements Nutrition,Beijing 100050,China; 3.School of Food and Chemical Engineering,Beijing Technology and Business University,Beijing 100048,China)

腸道菌群的組成和分布與宿主的代謝活動密切相關，不同腸道菌群結構會導致宿主對肥胖及代謝相關疾病的敏感性不同。一項對丹麥人123例非肥胖個體樣本和169例肥胖個體樣本的研究表明，菌群豐度低的人更容易有肥胖、胰島素抵抗、血脂異常以及與炎癥相關的一些特征，并且在肥胖個體中間，低菌群豐度個體比高菌群豐度個體更容易發胖[1]。另外一項胖瘦雙胞胎菌群的移植實驗表明，在健康飲食的情況下，接受了肥胖個體菌群的小鼠體質量和脂肪的增加顯著高于接受“瘦菌群”的小鼠；而在同樣的高脂飲食情況下，移植了瘦人腸道菌群的小鼠沒有發生明顯的肥胖[2]。除了膳食和環境的外因，肥胖發生的一個重要內因是腸道菌群結構失調引起的全身慢性炎癥反應，敲除了炎癥毒素受體CD14的小鼠，不會發生因注射毒素引起的肥胖[3]。在肥胖個體的脂肪或血清中，能夠觀察到高水平的炎癥因子如白細胞介素1（interleukin-1，IL-1）、白細胞介素6（interleukin-6，IL-6）、白細胞介素IL-8（interleukin-8，IL-8），腫瘤壞子因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等。

炎癥因子的釋放受到早期核轉錄因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）的正向調控和氧化物酶體增殖物激活受體（peroxisome proliferator-activated receptor，PPARγ）的負調控[4-5]。本研究利用不同人源腸道菌群（human flora-associated，HFA）無菌小鼠模型[6-7]，通過測定不同組小鼠腸道菌譜、部分生化指標以及相關炎癥因子表達水平的變化，研究高脂飼料模式下“胖菌群”和“瘦菌群”小鼠腸道菌群及NF-κB炎癥通路的不同反應，以闡明高脂飲食-腸道菌群-宿主炎癥通路代謝水平三者之間的關系。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人的糞便樣本：通過體質量、遺傳病、吸煙、飲酒指標的篩選，從6對父子或母女志愿者中選擇了一對母女作為糞便樣本的提供者。納入實驗的基本標準為一對志愿者應該是父子或母女，二人體質指數（body mass index，BMI）值分別為肥胖和正常，血脂四項和血糖指標正常，沒有遺傳病或代謝相關疾病，不吸煙、不飲酒。

C57BL/6無菌小鼠（雌性，7～8周齡，體質量17.4～20.0 g）：購于中國醫學科學院醫學實驗動物研究所，飼養環境，無菌隔離器；C57BL/6 SPF小鼠（雌性，7～8周齡，體質量18～22g）：購于北京維通利華實驗動物技術有限公司。

動物飼料：無菌鼠基礎飼料，購于中國醫學科學院醫學實驗動物研究所；普通小鼠基礎飼料，購于軍事醫學科學院實驗動物中心；無菌高脂飼料，定制于軍事醫學科學院實驗動物中心；高脂飲食配方：78.8%基礎飼料中加入10%豬油、10%蛋黃粉、1%膽固醇、0.2%膽酸鹽。

總膽固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triacylglyceride，TG）、高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）檢測試劑盒：北京利德曼生化股份有限公司；

核糖核酸酶抑制劑（ribonucleoseInhibitor，RI）、禽成髓細胞白血病病毒（avian myeloblastosis virus，AMV）逆轉錄酶：美國Invitrogen公司；2×PCR mix：德國QIAGEN公司；YAD-D1130小鼠IL-1、YAD-D1026小鼠IL-6、YAD-D1050小鼠IL-8、YAD-D1055小鼠TNF-α酶聯免疫吸附試驗（enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA）檢測試劑盒：北京雅安達生物技術有限公司；腸道菌群檢測（腸道細菌DNA提取試劑盒）：華大基因。

1.2 儀器與設備

7100全自動生化分析儀：日本日立有限公司；NANO DROP紫外分光光度計、LabsystemsAC8洗板機：美國Thermo有限公司；POWERPAC3000電泳儀、DNASUBCELL水平電泳儀：美國BIO RAD有限公司；GIS-1600凝膠成像系統：上海天能科技有限公司；ABI ViiA 7實時熒光定量PCR系統：美國Applied Biosystems公司；NANO Quant infinite M200PRO多功能酶標儀：瑞士TECAN公司；DNM-9602酶標儀：北京普朗新技術有限公司；HiSeq 2000 DNA測序儀：美國Illumina有限公司。

1.3 方法

1.3.1 志愿者體檢

志愿者自愿參與實驗，簽訂“知情同意書”后進行血液、尿液和糞便的樣本的相關體檢。檢測項目包括：身高、體質量、體脂率、尿常規、便常規、血常規、血脂四項（TC、TG、HDL-C、LDL-C）以及炎癥因子水平（IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α）。根據檢測指標確定志愿者糞便樣品是否納入實驗。

1.3.2 不同菌群來源HFA-小鼠模型建立

在志愿者身體狀況良好的時候，收集志愿者清晨第1次排出的新鮮糞便，迅速置于無菌厭氧管中，一部分-80℃冷凍保存用于腸道菌群高通量測序，另一部分參考張曉婧等[8]的方法稀釋成1%的懸液待用。將C57BL/6無菌小鼠10只按體質量隨機分為2組，每組5只。在分組后的第1、3、7天按照2 mL/100 g的量灌胃人腸道菌懸液，第1組灌胃母親菌群樣本，第2組灌胃女兒菌群樣本，分別建立不同菌群來源（HFA）-小鼠模型。

1.3.3 動物實驗

C57BL/6 SPF小鼠14只作為第3組，小鼠自身腸道菌群對照組與上述兩組共同進行動物實驗。在無菌鼠腸道菌群定殖完成后，分別取3組小鼠糞便-80℃冷凍保存備用，然后將3組小鼠的飼料統一更換為高脂飼料。實驗期間自由進食和飲水，連續喂養6周，每周稱質量1次。實驗結束后，所有動物禁食12 h，稱體質量，取每只小鼠糞便用于腸道菌群檢測；小鼠經戊巴比妥鈉麻醉[9]后腹主動脈取血，離心取血清用于血脂和炎癥因子水平檢測；取肝臟、生殖周脂肪稱質量，其中脂肪用于NF-κB和PPARγ基因表達水平的檢測。上述全部生物樣本于-80℃冷凍保存備用。

動物實驗已通過中國疾病預防控制中心營養與健康所倫理審查。

1.3.4 腸道菌群高通量測序分析

使用華大基因研發的腸道細菌脫氧核糖核酸（deoxyribo nucleicacid，DNA）提取試劑盒對志愿者和小鼠的糞便樣本進行DNA提取，并使用通用引物515F（5′-GTGCCAGCMG CCGCGGTAA-3′和806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCT AAT-3′）對其16SRDNA的V4區進行聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增。

將擴增產物在Illumina平臺進行雙末端測序，下機后得到reads數據，去除低質量reads后使用拼接軟件FLASH將其拼接為Tags，拼接的Tags經過優化后，在97%相似度下將其聚類為物種分類的分類操作單位（operational taxonomic units，OUT）用于物種注釋[10-11]。

1.3.5 炎癥因子水平ELISA測定

按照檢測試劑盒說明書制備標準品，稀釋5個梯度，每個梯度每孔加樣量50 μL。分別設置空白孔和待測樣品孔，根據說明書加樣并進行相應反應。反應終止后，以空白孔調零，450 nm波長依序測量各孔的光密度（OD450nm）值。以標準物（IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α）的質量濃度（x）為縱坐標，OD450nm值（y）為橫坐標，繪制各標準物標準曲線，計算出各標準曲線的回歸方程（IL-1：y=899.4x-112.17，R2=0.997 7；IL-6：y=45.093x-6.5148，R2=0.9970；IL-8：y=178.81x-20.804，R2=0.996 7；TNF-α，y=446.75x-52.455，R2=0.998 3），按照標準曲線的回歸方程計算樣品的IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α含量。

1.3.6NF-κB和PPARγ基因表達水平實時熒光定量PCR檢測

分別提取各個小鼠脂肪樣本的總核糖核酸（ribonucleic acid，RNA），參照RNA提取試劑盒的步驟完成，將干燥后的RNA溶解于RNA-free水中，取1 μL測定OD260nm，并定量。

逆轉錄反應體系為：二乙基焦碳酸酯（diethyl procarbonate，DEPC）處理過的滅菌蒸餾水（8－x）μL，RNA酶抑制劑（50 U/μL）0.5 μL，隨機引物（50 pmol/L）2 μL，RNA x μL（2 μg），而總RNA體積與DEPC水的總體積是8 μL。上述離心管于65℃水浴處理5 min，室溫放置10 min，高速（＞5 000×g）離心5 s；然后按下列順序在1.5 mL離心管加入下列反應物（加入之后總體積為20 μL）：RNA酶抑制劑（50 U/μL）0.5 μL，5×buffer 4 μL，脫氧核糖核苷三磷酸（deoxyribonucleoside triphosphate，dNTP）MIX（10 mmol/L）2μL，二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）2μL，AMV（200 U/μL）1 μL。40℃水浴1 h，90℃處理10 min，冰浴5 min后高速（＞5 000×g）離心5 s。

設計引物（表1）對目的片段進行PCR擴增，以β-肌動蛋白（β-actin）作為內參。PCR反應體系為：H2O 6.6 μL，2× PCR MIX 8 μL，上游引物（50 pmol/L）0.2 μL，下游引物（50 pmol/L）0.2 μL，就是反轉錄產物1 μL。反應條件為：95℃反應2 min后，94℃10 s，60℃10 s，72℃40 s，反應40個循環。

表1 目的片段引物序列Table 1 Primer sequence of target fragments

1.3.7 結果統計

利用統計分析軟件SPSS 16.0處理得到的數據，采用ANOVA進行方差分析，比較P值，P≥0.05為無顯著差異，P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 志愿者體檢結果

體檢結果顯示，志愿者血、尿、便常規檢測均正常，其他指標檢測結果見表2，母親和女兒的腰圍、BMI值以及體脂率分別表明其屬于肥胖和正常個體。血脂四項指標中，母親的LDL-C偏高，女兒血脂正常。炎癥因子指標顯示，二人均有個別炎癥因子水平偏高，但無臨床癥狀表現。綜合上述體檢結果，確定以該組志愿者作為腸道菌群來源。

表2 志愿者體檢結果Table 2 Physical examination results of the volunteers

2.2 志愿者及各組小鼠腸道菌譜檢測結果

下機數據經過清洗拼接[12]后所得到的OTU進行物種注釋分析。志愿者腸道菌群檢測中，母親（H1）的菌群樣本得到OTU數量為280，女兒（H2）得到OTU數量為194。小鼠腸道檢測中，高脂飼料使用前，1，2，3組得到OTU數量分別為246，284，456；實驗結束后，1，2，3組得到OTU數量分別為228，300，469。全部樣品共注釋到11個細菌門類，分別為放線菌門（Actinobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、藍藻細菌門（Cyanobacteria）、脫鐵桿菌門（Deferribacteres）、厚壁菌門（Firmicutes）、黏膠球形菌門（Lentisphaerae）、變形菌門（Proteobacteria）、互養菌門（Synergistetes）、TM7菌門（細菌域下的一個門）、柔膜菌門（Tenericutes）和疣微菌門（Verrucomicrobia），H1樣本中檢測到6個門，H2中檢測到8個門，志愿者及各組小鼠菌相組成如圖1所示。

厚壁菌門與擬桿菌門的比值可作為判定肥胖潛在可能的依據[13-15]，且肥胖個體的腸道菌群更容易受到飲食的影響而發生變化，而纖瘦個體腸道菌群相對穩定，不容易隨著飲食的改變而改變[16]。本實驗中1、2、3組小鼠實驗前后該比值分別為23.3%、61.0%和41.3%及45.6、75.0和55.9，可知第1組實驗前后相差最大。也就是說在高脂飼料喂養模式下，來自母親腸道的菌群結構更容易發生變化，而來自女兒的腸道菌群結構相對穩定，與已有研究結果一致。

圖1 志愿者和小鼠腸道菌群在門水平上的注釋結果Fig.1 Taxonomic composition distribution in samples of Phylum-level

各個糞便樣本在屬水平的分類注釋如圖1所示。由圖1可知，使用高脂飼料前，人源腸道菌群的組成和比例在無菌鼠體內定殖的過程中發生了變化，如H1中的毛螺菌屬在1組小鼠內定殖后未檢測到，1組小鼠中檢測到了H1中沒有的Bilophila菌屬；H2到第2組的定殖過程，腸道菌群也有差異，可能是菌群所處人和鼠的不同腸道代謝環境導致了這一變化。而高脂飼料使用前后，普通小鼠腸道菌群與人源HFA-小鼠腸道菌群都表現出較大差異。

實驗前后腸道菌譜比較結果見圖2，由整體菌群結構可知1、3組小鼠腸道菌群受到飲食影響較大。兩組中優勢菌相擬桿菌屬（Bacteroides）的組成比例分別由61.9%降低為40.5%，由2.0%增加為7.1%；非優勢菌相中，1組中的Akkermansia、Blautia、Dorea、埃希氏菌屬（Escherichia）和Turicibacter5個菌屬分別增加為原來的70.4倍、3.9倍、13.3倍、4.5倍和311倍，Alistipes和乳桿菌屬（Lactobacillus）2個菌屬減少為原來的1/5和1/10；3組中的Alistipes、埃希氏菌屬（Escherichia），乳桿菌屬（Lactobacillus），薩特氏菌屬（Sutterella）和Turicibacter5個菌屬分別增加為原來的6.8倍，4.8倍，3.1倍，3.3倍和5.9倍，Akkermansia和葡萄球菌屬（Staphylococcus）2個菌屬減少為原來的1/5和1/10。在ARSLAN M等[16]的研究中發現，低豐度腸道菌群有著巨大的被膳食干預的潛能，而低豐度菌群的宿主特征往往與肥胖相關，與本研究結果一致：胖菌群更容易被高脂飲食影響。高脂飼料喂養前后，第2組小鼠腸道菌群組成變化最小，實驗后擬桿菌屬（Bacteroides）由31.2%增加為39.4%，Parabacteroides屬由18.9%降低為8.4%；另有一些組成比例很小的菌屬數量有所下降，如糞球菌屬（Coprococcus），Paraprevotella屬等。由圖2的菌群結構圖可知，高脂模式下H2腸道菌群結構相對穩定。

圖2 志愿者和小鼠腸道菌群在屬水平上的注釋結果Fig.2 Taxonomic composition distribution in samples of Genus-level

2.3 實驗動物生理生化指標檢測結果

實驗前后各組小鼠體質量，實驗后小鼠肝臟、生殖周脂肪質量，血脂四項指標以及炎癥因子水平結果見表3。

表3 各組小鼠生理生化指標測定結果Table 3 Determined results of physiological and biochemical indexes in different groups

由表3可知，實驗前后，各組小鼠的上述指標除生殖周脂肪外，均無顯著差異。第2組小鼠生殖周脂肪質量顯著低于1、3組（P＜0.05），生殖周脂肪能夠在一定程度上表示個體肥胖的趨勢，本實驗結果表明，定殖了“瘦菌群”的HFA-小鼠肥胖的趨勢最小。各組小鼠血脂四項和炎癥因子指標在實驗前后均未表現出差異，接下來對其調控基因做進一步分析。

2.4PPARγ和NF-κBmRNA相對表達量測定結果

實時熒光定量PCR結果見圖3。由圖3可知，1組小鼠PPARγ和NF-κBmRNA相對表達量顯著高于2組。NF-κB因子的活化使炎癥因子釋放增多[17]，而PPARγ可通過與NF-κB間蛋白-蛋白相互作用，阻止NF-κB與炎癥因子基因啟動子區的同源順式元件結合，抑制炎癥反應[18]。肥胖狀態下，巨噬細胞釋放炎癥因子，如IL-1、TNF-α等，引起炎癥的級聯反應。本實驗中，雖然各組炎癥因子水平未檢測到差異，但其調控基因已經在不同組的小鼠中出現了不同的表達水平。根據“胖菌群”HFA-小鼠中兩個基因表達水平的上調推斷該組小鼠體內具有炎癥反應的趨勢，血液中炎癥水平未檢測到升高，可能是由于高表達水平的PPARγ暫時抑制了更高水平的炎癥反應。因而，可以進一步推斷在高脂模式下，“胖菌群”小鼠發生炎癥反應以及肥胖的風險高于“瘦菌群”小鼠，而腸道菌群可能是引起基因表達水平變化，進而引起炎癥反應的原因。

圖3PPARγ和NF-κB mRNA相對表達量Fig.3 Relative abundance ofPPARγandNF-κBmRNA

3 結論

不同人源腸道菌群定殖到無菌鼠腸道后，與普通小鼠原有菌群存在顯著差異，在飼養過程中，能夠在無菌小鼠體內保持原有的組成結構特征。與“瘦菌群”HFA-小鼠相比，“胖菌群”HFA-小鼠在高脂飼料模式下，腸道菌群的組成和比例變化更加明顯，菌群結構組成不穩定?！芭志骸毙∈笤诟咧暳衔桂B后，血脂和炎癥因子水平未表現出異常，但PPARγ和NF-κBmRNA相對表達量上調，表明了該組小鼠具有炎癥和肥胖發生的趨勢。推測腸道菌群能夠通過影響PPARγ和NF-κB兩個基因的表達而引起炎癥反應，有待于進一步研究證實。

[1]CHATELIER E L,NIELSEN T,QIN J,et al.Richness of human gut microbiome correlates with metabolic markers[J].Nature,2013,500(7464): 541-546.

[2]RIDAURA V K,FAITH J J,REY F E,et al.Gut microbiota from twins discordant for obesity modulate metabolism in mice[J].Science,2013, 341(6150):1079-1089.

[3]CANI P D,AMAR J,IGLESIAS M A,et al.Metabolic endotoxemia initiates obesity and insulin resistance[J].Diabetes,2007,56(7):1761-72.

[4]NYATI K K,MASUDA K,ZAMAN M M,et al.TLR4-induced NF-κB and MAPK signaling regulate the IL-6 mRNA stabilizing protein Arid5a [J]. Nucl Acid Res,2017,45(5):2687-2703.

[5]BHAT O M,UDAY K P,HARISHANKAR N,et al.Interleukin-18-induced cell adhesion molecule expression is associated with feedback regulation by PPAR-γ and NF-κB in Apo E-/-mice[J].Mol Cell Biochem, 2017,428(1-2):119-128.

[6]YUAN J,ZENG B,NIU R,et al.The Development and stability of the genus bacteriodes,from human GUT microbiota in HFA mice model[J]. Curr Microbiol,2011,62(4):1107-1112.

[7]BHATTARAI Y,KASHYAP P C.Germ-free mice model for studying host-microbial interactions[J].Methods Mol Biol,2016,1438:123-135.

[8]張曉婧，曾本華，劉智偉，等.兩種不同品系小鼠的人源菌群模型的建立與腸道菌群的比較[J].中國微生態學雜志，2013，25（4）：376-380.

[9]馮桂香，王婭，何華瓊.氨基甲酸乙酯、水合氯醛、戊巴比妥鈉對小白鼠麻醉效果淺析[J].醫藥前沿，2013（9）：366.

[10]DESANTIS T Z,HUGENHOLTZ P,LARSEN N,et al.Greengenes,a chimera-checked 16S rRNA gene database and workbench compatible with ARB[J].Appl Environ Microbiol,2006,72(7):5069-5072.

[11]COLE J R.Ribosomal database project:data and tools for high throughput rRNA analysis[J].Nuclei Acid Res,2014,42:633-642.

[12]EDGAR R C.UPARSE:highly accurate OTU sequences from microbial amplicon reads[J].Nat Method,2013,10(10):996-1030.

[13]LEY R E,B?CKHED F,TURNBAUGH P,et al.Obesity alters gut microbial ecology[J]. P Natl Acad USA,2005,102(31):11070-11075.

[14]TURNBAUGH P J,LEY R E,MAHOWALD M A,et al.The gut microbiome as a biomarker and therapeutic target for treating obesity or an obesity related disorder:US,EP2102350[P].2009-09-23.

[15]SANDERSON S,BOARDMAN W,CIOFI C,et al.Human gut microbes associated with obesity[J].Nature,2006,444(7122):1022-1023.

[16]ARSLAN M,MARTINI A,RAZZOLINI R,et al.Dietary intervention impact on gut microbial gene richness[J].Nature,2013,500(7464): 585-588.

[17]RHODUS N L,CHENG B,MYERS S,et al.A comparison of the pro-inflammatory,NF-kappaB-dependent cytokines:TNF-alpha,IL-1-alpha,IL-6,and IL-8 in different oral fluids from oral lichen planus patients[J].Clin Immunol,2005,114(3):278-283.

[18]TAKATA Y,KITAMI Y,NAKAMURA M,et al.PPARγ activators inhibit IL-1β-induced IL-6 activation via C/EBPΔ suppression in vascular smooth muscle cells[J].J Hypertens,2000,18(6):S180-S181.

R589.2

0254-5071（2017）05-0141-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.05.030

2017-02-24

科技部-國家重點研發計劃課題（2016YFD0400602）

高潔（1983-），女，助理研究員，博士，研究方向為益生菌，腸道微生態。

*通訊作者：霍軍生（1962-），男，研究員，博士，研究方向為食品生物技術，強化食品。