紫色紅曲霉FBKL3.0018產酯化酶的酶學性質研究

胡娜，吳鑫穎*，李付麗，王艷，邱樹毅，吳海

（1.貴州大學貴州省發酵工程與生物制藥重點實驗室，貴州貴陽550025；2.貴州大學釀酒與食品工程學院，貴州貴陽550025；3.青酒集團有限公司，貴州黔東南556000）

紫色紅曲霉FBKL3.0018產酯化酶的酶學性質研究

胡娜1，2，吳鑫穎1，2*，李付麗1，2，王艷1，2，邱樹毅1，2，吳海3

（1.貴州大學貴州省發酵工程與生物制藥重點實驗室，貴州貴陽550025；2.貴州大學釀酒與食品工程學院，貴州貴陽550025；3.青酒集團有限公司，貴州黔東南556000）

以從紫色紅曲霉FBKL3.0018中固態發酵得到的粗酶制劑為研究對象，對該菌株的酯化酶酶學性質進行了較系統的研究。通過單因素實驗確定該酶最適溫度為40℃，在30℃條件下穩定性較好，最適pH值為6.5，在pH5.5～7.5條件下穩定性好。Fe2+、Na+、Mn2+、Mg2+、Li+、Zn2+對酯化酶酶活力有抑制作用，Ca2+在低濃度時有促進作用，高濃度時有抑制作用。K+對酯化酶酶活力有促進作用，并且隨著K+濃度的升高，促進作用逐漸增強。吐溫-80、十二烷基硫酸鈉（SDS）、聚乙二醇6000、阿拉伯膠4種表面活性劑對酯化酶酶活力都有抑制作用。另外，甲醇和乙醇對該酯化酶酶活力有抑制作用，甲酸、乙酸、乳酸對酯化酶酶活力有促進作用。乙酸乙酯在低濃度時對酯化酶酶活力有抑制作用，含量為30%時反而有促進酶活力的作用。酯化酶最大反應速度Vmax為0.016 mol/（L·min），米氏常數Km為0.015 4 mol/L。

紫色紅曲霉；固態發酵；酯化酶；酶學性質

HU Na1,2,WU Xinying1,2*,LI Fuli1,2,WANG Yan1,2,QIU Shuyi1,2,WU Hai3
(1.Guizhou Key Lab of Fermentation Engineering and Biological Pharmacy,Guizhou University,Guiyang 550025,China;2.School of Liquor and Food Engineering,Guizhou University,Guiyang 550025,China;3.Qingjiu Group Co.,Ltd.,Qiandongnan 556000,China)

酯化酶包括脂肪酶和酯酶，酯酶（羧酸酯酶carboxylesterases）與脂肪酶功能相似，都可以催化酯類的水解與合成[1]。白酒生產上常用高產酯化酶的菌株以及酯化酶制劑來提高酯的合成，有利于增加白酒香味成分中酯的含量[2-5]。目前，關于酯化酶酶學性質的研究主要集中在酶的最適反應溫度，最適pH值，溫度穩定性，酸堿穩定性，金屬離子、表面活性劑和有機溶劑等對酶活性的影響等[6]。

胡長浩等[7]對金黃色釀膿葡萄球菌（Staphylococcus aureus）FL-12產耐熱性脂肪酶的酶學性質進行了研究，發現脂肪酶的最適溫度是45℃，最適pH值為10，有較好的酸堿穩定性和溫度穩定性。K+對該酶有激活作用，Pb2+、Ba2+有抑制作用，低濃度十二烷基硫酸鈉（sodiumdodecylsulfate，SDS）抑制該酶的活性，低濃度乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraaceticacid，EDTA）對該酶幾乎沒有影響；1%的TritonX 100和吐溫-80對酶活有促進作用。胡朝陽等[8]對不動桿菌GXL02產脂肪酶的酶學性質進行了研究，發現酶的最適溫度為50℃，最適pH值為9.0，具有較好的溫度穩定性和pH穩定性。王琰等[9]對真菌FL002產耐酸性脂肪酶的酶學性質進行研究，結果發現，最適pH為6.5，在pH6.0～8.5之間，酶的穩定性較好，40℃時酶具有很好的穩定性。研究還發現，Fe2+、Ca2+對脂肪酶活性產生抑制作用，Cu2+、Ni2+抑制作用明顯，這跟其他脂肪酶的酶學性質研究結果不同。黑曲霉產生的脂肪酶的活性受到多種金屬離子抑制，但對Ca2+卻有依賴性[10]，表明不同菌種來源的脂肪酶有不同的酶學性質。SDS對脂肪酶有很強的抑制作用，而Triton-100卻有明顯激活作用。另外，吐溫-80對酶活性基本上沒有影響[11]。

本研究從濃香型白酒釀造的中溫大曲中篩選一株高產酯化酶的菌株（紫色紅曲霉FBKL3.0018），以此菌株固態發酵所得的酯化酶粗酶制劑為研究對象，進行酶學性質研究，為濃香型白酒生產過程中產酯產香和黃水的回收利用等方面奠定良好的研究基礎[12]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紫色紅曲霉FBKL3.0018：保存于貴州省發酵工程與生物制藥重點實驗室。

所用原料為固態發酵所得的含酶培養物（簡稱粗酶制劑）。

Tris、鹽酸磷酸二氫鈉、甘氨酸、硫酸鎂、體積分數95%乙醇、橄欖油、聚乙二醇、檸檬酸、檸檬酸鈉、氫氧化鈉、一水和硫酸錳、吐溫80、SDS、七水和硫酸亞鐵、無水硫酸鎂、無水氯化鈣、磷酸氫二鈉、磷酸氫二鉀（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

UV2550紫外可見分光光度計：日本島津集團；MJX-250B-Z霉菌培養箱、BXM-30R立式壓力蒸汽滅菌器：上海博訊實業有限公司醫療設備廠；JJ-CJ-1FD潔凈工作臺：蘇州市金凈凈化設備科技有限公司；DK-98-11電熱恒溫水浴鍋：天津市泰斯特儀器有限公司；XW-80A旋渦混合儀：海門市杜琪貝爾儀器制造有限公司；BCD-215DK冰箱：青島海爾股份有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 酶活測定方法

酯化酶酶活定義：1g含酶培養物于40℃、pH7.5的條件下，水解脂肪每分鐘生成1μmol的脂肪酸定義為1個酶活力單位，U。

酯化酶酶活的測定方法：按照參考文獻[13]的方法進行，并根據以下公式進行計算。

X=（B-A）×c/0.05 ×50 ×1/15 ×n=200/3 ×（B-A）×c ×n

式中：X為樣品酶活力，U/g；B為滴定樣品時消耗氫氧化鈉標準溶液的體積，mL；A為滴定空白時消耗氫氧化鈉標準溶液的體積，mL；c為氫氧化鈉標準溶液濃度，mol/L；0.05為氫氧化鈉標準溶液濃度換算系數；50為0.05mol/L氫氧化鈉溶液1.00mL相當于脂肪酸50μmol；1/15為反應時間15 min，以1 min計；n為稀釋倍數。

1.3.2 最適溫度及其穩定性

按照酶活力測定方法，測定酯化酶在20℃、30℃、40℃、50℃、60℃環境中的酶活。以酶活力最高時為100%，計算相對酶活，確定酶的最適溫度。

將酯化酶制劑分別在30℃、40℃、50℃溫度環境中保溫7 h，分別在1 h、2 h、3 h、5 h、7 h時測定酯化酶殘余酶活。以保溫處理前的初始的酶活力為100%，計算保溫處理后殘余的相對酶活。

1.3.3 最適pH及其穩定性

按照酶活力測定方法，測定酯化酶在pH5.5、pH6.5、pH7.5、pH8.5、pH9.5的緩沖溶液中的酶活。以酶活力最高時計為100%，計算相對酶活，確定酶的最適pH。

將酯化酶制劑在以上pH值條件下室溫放置24 h，分別在0 h、4 h、8 h、12 h、24 h時測定酯化酶殘余酶活。以處理前的初始的酶活力為100%，來計算處理后殘余的相對酶活。1.3.4金屬離子對酶活的影響

將酯化酶制劑與不同含量的FeSO4、MnSO4、MgSO4、CaCl2、ZnCl2、LiSO4、CuSO4、FeCl3溶液以1∶9（V/V）的比例混合均勻，使混合后的各離子濃度為1 mmol/L、5 mmol/L、10 mmol/L。室溫（25℃）條件下放置1 h，最適條件下測定酶活力。對照組以相同體積的蒸餾水代替金屬離子溶液，將對照組酶活力計為100%，計算各相對酶活。

1.3.5 表面活性劑對酶活的影響

將酯化酶制劑與不同濃度的吐溫-80、SDS、聚乙二醇6000、阿拉伯膠溶液以1∶9（V/V）的比例混合均勻，使混合后的表面活性劑溶液含量為0.05%、0.1%、0.5%。室溫（25℃）條件下放置2 h，最適條件下測定酶活力。對照組以相同體積的蒸餾水代替表面活性劑溶液，將對照組酶活力計為100%，計算各相對酶活。

1.3.6 有機溶劑對酶活的影響

將酯化酶制劑與甲醇、乙醇、甲酸、乙酸、乳酸、乙酸乙酯以適當比例混合均勻，使混合后的有機溶液含量分別為10%、15%、20%、25%、30%。室溫（25℃）條件下放置24h，最適條件下測定酶活力。對照組采用相同體積的蒸餾水代替有機溶劑溶液，將對照組酶活力計為100%，計算各相對酶活。

1.3.7 酯化酶米氏常數Km和最大反應速度Vmax值的測定

分別配制100 mmol/L、120 mmol/L、140 mmol/L、160 mmol/L、180 mmol/L、200 mmol/L、300 mmol/L、400 mmol/L、500 mmol/L的不同濃度（S）橄欖油乳化液，在最適條件下進行反應，測定其水解反應速度（V）。繪制1/S與1/V的線性方程，計算酶反應的Km、Vmax值。

2 結果與分析

2.1 最適反應溫度

酯化酶在不同的溫度條件下其酶活的測定結果見圖1。

由圖1可知，酯化酶在40℃條件下反應時酶活力最高。在一定范圍內，隨著溫度的升高，酶活升高。但過高的溫度會使酶失活。以40℃反應時的酶活力為100%，30℃時酶活力為65%左右，超過40℃酶活力急劇下降。這與參考文獻[14]中根霉產酯化酶最適溫度40℃相符合。因此，該酯化酶的最適反應溫度為40℃。

圖1 溫度對酯化酶酶活的影響Fig.1 Effect of temperature on esterifying enzyme activity

2.2 溫度穩定性

圖2 酯化酶溫度穩定性Fig.2 Temperature stability of esterifying enzyme activity

由圖2可知，30℃條件下酯化酶酶活力下降較緩慢，3 h時酯化酶活力仍保持在87.93%左右，7 h時酯化酶殘余酶活力為60.87%。40℃條件下，酯化酶酶活力在2 h時酶活力降為82.76%，之后酶活力下降迅速，7 h時酶活力僅剩初始酶活力的13.91%。50℃條件下，酯化酶酶活力下降非常迅速，1 h時酶活力僅為9.48%，7 h時酶活力僅為初始酶活力的5.22%。由此可以得出，該酯化酶在30℃條件下穩定性較好，隨溫度的升高穩定性變差，當溫度達到50℃時，酯化酶的酶活力損失已經很大，該溫度下酯化酶穩定性很差。

2.3 最適pH值

圖3pH值對酯化酶酶活的影響Fig.3 Effect of pH on esterifying enzyme activity

由圖3可知，隨著pH值升高，酶活升高，在pH6.5條件下酶活力達到最高，之后隨著pH值升高，酶活力迅速下降。在一定范圍內，隨著pH的升高，酶活升高，但過高的pH會使酶失活。因此，該酯化酶的最適pH值為6.5。該結果與大多數真菌酯化酶最適pH在弱酸性或中性范圍內相符合[15]。

2.4 pH穩定性

圖4 酯化酶的pH穩定性Fig.4 pH stability of esterifying enzyme

由圖4可知，4 h時測定酯化酶活力結果發現，酯化酶活力下降，其中pH為6.5時酶活力下降最快，為初始酶活力的74.84%。pH為8.5時酶活力下降幅度最小，為初始酶活力的98.41%。4～12 h時，5個pH條件下酶活力都是持續下降。12～24 h時，pH8.5條件下酶活力下降最快且幅度最大，降至初始酶活力的39.68%，pH9.5時酶活力降至初始酶活力的42.68%。pH5.5、pH6.5、pH7.5條件下酶活力繼續下降，但下降幅度較小。

從整體來看，偏堿性條件下，酯化酶的穩定性較差，僅24 h就降至初始酶活力的40%左右。pH5.5、pH6.5、pH7.5條件下，酯化酶的穩定性較好，其中pH7.5條件下，酯化酶的穩定性最好，24 h后酶活力為初始酶活力的68.70%。因此，該酯化酶在pH5.5～7.5穩定性較好。該實驗結果與少根根霉（Rhizopus arrhizus）BUCT產酯化酶在pH6.0～8.0范圍內酶活都較穩定相類似[16]。

2.5 金屬離子對酶活的影響

圖5 不同金屬離子濃度對酯化酶活性的影響Fig.5 Effect of different metal ions concentration on esterifying enzyme activity

由圖5可知，Fe2+、Na+在低濃度時對酯化酶酶活力有抑制作用，但隨著金屬離子濃度升高，Fe2+、Na+對酯化酶酶活力的抑制作用減弱，而且有促進作用。Ca2+卻與此相反，低濃度時對酯化酶酶活力有促進作用，高濃度時對酯化酶酶活力有抑制作用。Mn2+、Mg2+、Li+對酯化酶酶活力有抑制作用，但隨著金屬離子濃度升高，這種抑制作用會減弱。Zn2+對酯化酶酶活力也有抑制作用，但隨著金屬離子濃度的升高，抑制作用逐漸增強。K+對酯化酶酶活力有促進作用，并且隨著K+濃度的升高，促進作用逐漸增強。一般來說，Ca2+可提高酯化酶酶活穩定性和酶活，Zn2+和Mg2+在一定程度上也可抑制酯化酶活性[17]。

2.6 表面活性劑對酶活的影響

圖6 表面活性劑對酯化酶活性的影響Fig.6 Effect of surface active agents on esterifying enzyme activity

由圖6可知，4種表面活性劑對酯化酶酶活力都有抑制作用。其中，吐溫-80對酯化酶酶活力在低濃度時抑制最低，當吐溫-80含量達到0.5%時，酶活力為初始酶活力的84.55%，其酶活降低不大。SDS對酶活抑制作用在低濃度時就有抑制，但在高濃度時（0.50%）抑制作用最強，其殘余酶活力僅為初始酶活力的27.27%。聚乙二醇6000及阿拉伯膠對酶活的抑制作用在高濃度時反而較弱，低濃度時較強。相比之下，阿拉伯膠抑制作用整體低于聚乙二醇6000。這與參考文獻[18]中表面活性劑吐溫-80對脂肪酶酶活影響不大，而SDS則起抑制作用相符合。

2.7 酯化酶對有機溶劑的耐受性

圖7 酯化酶對有機溶劑的耐受性Fig.7 Tolerance of esterifying enzymes in organic solvents

由圖7可知，甲醇和乙醇對該酯化酶酶活力有抑制作用，甲酸、乙酸、乳酸對酯化酶酶活力有促進作用。乙酸乙酯在低濃度時對酯化酶酶活力有抑制作用，含量為30%時反而有促進酶活力的作用。

甲醇在含量10%的條件下對酯化酶酶活力有較弱的抑制作用，殘余酶活力為初始酶活力的83.33%，但含量為30%時，抑制作用顯著增強，殘余酶活力僅為初始酶活力的16.18%。乙醇在含量為10%時對酯化酶酶活力的抑制作用就較強，殘余酶活力為初始酶活力的40.91%，乙醇含量為30%時抑制作用進一步加強，殘余酶活力為初始酶活力的38.24%。甲酸含量為10%時對酯化酶酶活力促進作用較強，酶活力達到初始酶活力的280.30%，而在含量為30%時促進作用減弱，為初始酶活力的142.65%。乙酸含量為10%時對酯化酶酶活力的促進作用最強，達到初始酶活力的424.24%，含量為30%時促進作用減弱，為初始酶活力的233.82%。對乳酸而言，其含量為10%時酶活力為初始酶活力的200%，含量30%時促進作用減弱，為初始酶活力的118.17%。乙酸乙酯在含量10%時對酯化酶酶活力有抑制作用，酶活力為初始酶活力的53.03%，但是當乙酸乙酯含量達到30%時，對酯化酶酶活力反而有促進作用，酶活力為初始酶活力的132.35%。

2.8 酯化酶Km和Vmax值的測定

圖8 酯化酶的酶促動力反應曲線Fig.8 Enzymatic dynamic response curve of esterifying enzyme

從圖8可以得出，由雙倒數法求得該酯化酶的最大反應速度Vmax為0.016mol/（L·min），米氏常數Km為0.0154mol/L。

3 結論

對紫色紅曲霉固態發酵得到的粗酶粉制劑進行酶學性質研究發現，酶的最適反應溫度為40℃，最適pH值為6.5，在30℃條件下穩定性較好，隨溫度的升高穩定性變差，在中性偏酸性條件下穩定性好。最大反應速度Vmax為0.016 mol/（L·min），米氏常數Km為0.015 4 mol/L。Fe2+、Na+、Mn2+、Mg2+、Li+、Zn2+對酯化酶酶活力有抑制作用，Ca2+在低濃度時有促進作用，高濃度時有抑制作用。K+對酯化酶酶活力有促進作用，并且隨著K+濃度的升高，促進作用逐漸增強。吐溫-80、SDS、聚乙二醇6000、阿拉伯膠4種表面活性劑對酯化酶酶活力都有抑制作用。另外，甲醇和乙醇對該酯化酶酶活力有抑制作用，甲酸、乙酸、乳酸對酯化酶酶活力有促進作用。乙酸乙酯在低濃度時對酯化酶酶活力有抑制作用，含量為30%時反而有促進酶活力的作用。

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TS261.1

0254-5071（2017）05-0123-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.05.026

2017-01-16

貴州省科技合作計劃項目（黔科合LH字【2014】7675號）；貴州省星火計劃項目（黔科合成轉字【2015】5337號）

胡娜（1993-），女，碩士研究生，研究方向為酶工程。

*通訊作者：吳鑫穎（1975-），女，副教授，碩士，研究方向為酶工程。