抗氧化脅迫促進(jìn)地衣芽孢桿菌合成桿菌肽

劉道奇，楊華，陳守文，李俊輝，陳雄，王志*

（1.發(fā)酵工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北省工業(yè)發(fā)酵協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北省工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北工業(yè)大學(xué)，湖北武漢430068；2.湖北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北武漢430062；3.綠康生化股份有限公司，福建浦城353400）

抗氧化脅迫促進(jìn)地衣芽孢桿菌合成桿菌肽

劉道奇1，楊華1，陳守文2，李俊輝3，陳雄1，王志1*

（1.發(fā)酵工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北省工業(yè)發(fā)酵協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北省工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北工業(yè)大學(xué)，湖北武漢430068；2.湖北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北武漢430062；3.綠康生化股份有限公司，福建浦城353400）

地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）發(fā)酵合成桿菌肽過程中存在的氧化脅迫影響了桿菌肽的合成效率。添加0.2%抗壞血酸和0.4%半胱氨酸使桿菌肽效價在搖瓶水平分別比對照提高了20.7%和29.4%。另外，胞內(nèi)過氧化氫酶活比對照分別降低了68.3%和43.8%。半胱氨酸合成加強(qiáng)工程菌株在10 L罐發(fā)酵過程中，峰值生物量（84×109CFU/mL，26 h）比出發(fā)菌株提高了9.0%，桿菌肽效價（1 090 U/mL，32 h）也提高了13.5%。Cys含量（213.3 mg/L，24 h）和過氧化氫酶活力（14～32 h）分別比對照提高了約60%和降低了15%～40%。說明Cys作為前體氨基酸參與桿菌肽合成與參與氧化自由基清除之間存在競爭關(guān)系，工程菌株通過增強(qiáng)Cys合成更好地滿足了細(xì)胞對兩者的生理需求，維持了細(xì)胞活性、促進(jìn)了桿菌肽合成效率。

地衣芽孢桿菌；桿菌肽；抗壞血酸；半胱氨酸；過氧化氫酶

LIU Daoqi1,YANG Hua1,CHEN Shouwen2,LI Junhui3,CHEN Xiong1,WANG Zhi1*
(1.Key Laboratory of Fermentation Engineering(Ministry of Education),Hubei Provincial Cooperative Innovation Center of Industrial Fermentation,Hubei Key Laboratory of Industrial Microbiology,Hubei University of Technology,Wuhan 430068,China; 2.Lifecome Bioengineering Institute of Hubei University,College of Life Sciences,Hubei University,Wuhan 430062,China; 3.Lifecome Biochemistry Co.,Ltd.,Pucheng,353400,China)

地衣芽胞桿菌以淀粉、豆粕等為主要原料進(jìn)行高密度發(fā)酵合成桿菌肽過程中，發(fā)酵液固形物含量高、黏度大，并且菌體生長迅速促使溶氧在發(fā)酵早期跌零，因此溶解氧是影響桿菌肽合成的關(guān)鍵因素[1-2]。曾新年等[3]在轉(zhuǎn)速為300 r/min和通風(fēng)量為600 L/h的發(fā)酵條件下通過流加雙氧水有效地緩解了供氧不足的問題，促進(jìn)了桿菌肽的合成效率，但發(fā)酵周期仍然過長（42 h）。提高攪拌速度和增加通氣流量可以促進(jìn)細(xì)胞生長和產(chǎn)物的合成，在本實(shí)驗(yàn)條件下（轉(zhuǎn)速600 r/min和通風(fēng)量600 L/h）發(fā)酵周期顯著縮短了約10 h，放罐效價略有提高。但是也出現(xiàn)了“新的矛盾”，表面上看是發(fā)酵中期細(xì)胞衰老自溶，桿菌肽合成效率難以維持。

細(xì)胞進(jìn)行有氧代謝過程中產(chǎn)生的過氧化氫（H2O2）、羧自由基（ROO·）、羥自由基（·OH）等會導(dǎo)致細(xì)胞衰老和生理代謝紊亂[4]。VOIGT B等[5]對地衣芽胞桿菌在發(fā)酵條件下的蛋白組學(xué)進(jìn)行了系統(tǒng)的分析，確定地衣芽胞桿菌在快速生長過程存在嚴(yán)重的氧化脅迫效應(yīng)，整個發(fā)酵周期過氧化氫酶和過氧化物還原酶被強(qiáng)烈而持續(xù)的誘導(dǎo)表達(dá)。因此，在高通風(fēng)和高轉(zhuǎn)速條件下促使地衣芽胞桿菌的生長代謝的同時，很可能也加劇了細(xì)胞清除高活性氧自由基的負(fù)擔(dān)，并對細(xì)胞造成了氧化脅迫，而突出的氧化脅迫很可能是上述“新的矛盾”的內(nèi)在因素，并使細(xì)胞活力急劇而持續(xù)的下降、自溶。

作為應(yīng)激反應(yīng)，細(xì)胞會激活氧自由基清除系統(tǒng)的表達(dá)，如超氧化物歧化酶、過氧化氫酶和過氧化物酶等酶系統(tǒng)[6]從而降低其對細(xì)胞的損害。另外，微生物生長代謝過程中也特異性的存在谷胱甘肽和半胱氨酸等非酶解氧化應(yīng)激的形式，這對于清除高活性氧自由基也起到了積極作用，趙素娟[7]研究了加入外源還原型谷胱甘肽后，可以提高釀酒酵母細(xì)胞存活率及膜完整性，降低O2-和H2O2水平。

基于以上分析，本試驗(yàn)基于發(fā)酵過程中胞內(nèi)過氧化氫酶活力和前體氨基酸濃度的時序變化趨勢，研究了還原性物質(zhì)—抗壞血酸（vitamin C，VC）和半胱氨酸對地衣芽孢桿菌生長和合成桿菌肽的影響，通過一株半胱氨酸合成加強(qiáng)型工程菌株在10 L發(fā)酵罐水平進(jìn)行驗(yàn)證，為抗氧化脅迫促進(jìn)桿菌肽合成的研究提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

地衣芽孢桿菌LC（BacilluslicheniformisLC）、半胱氨酸合成加強(qiáng)型地衣芽孢桿菌CY（Bacillus licheniformisCY）：湖北大學(xué)綠康生物工程研究所。

斜面培養(yǎng)基：酵母浸膏20 g/L，NaCl 5 g/L，瓊脂20 g/L，調(diào)pH 7.5。

種子培養(yǎng)基：豆粕50 g/L，玉米淀粉20 g/L，輕質(zhì)碳酸鈣4 g/L，（NH4）2SO41 g/L，玉米漿2.5 g/L。

發(fā)酵培養(yǎng)基：豆粕90 g/L，淀粉40 g/L，碳酸鈣4 g/L，硫酸銨0.7 g/L，蛋白胨10 g/L。

1.2 儀器與設(shè)備

DELTA 320 pH計(jì)：梅特勒托利多儀器（上海）有限公司；YXQ-LS-50SII立式壓力蒸汽滅菌器：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；CJ-2D型無菌操作臺：天津市泰斯特儀器有限公司；SGJ-10 L/C發(fā)酵罐：上海聯(lián)環(huán)生物工程設(shè)備有限公司；TG18M臺式高速離心機(jī)：長沙平凡儀器儀表有限公司；HNY-211B全溫振蕩培養(yǎng)箱：天津歐諾儀器儀表有限公司；5417R型冷凍離心機(jī)：Eppendorf（德國）公司；UVmini-1240紫外可見分光光度計(jì)：日本島津公司；PURELAB Flex 1/2/3/4純水儀：英國ELGA公司；E100光學(xué)顯微鏡：日本Nikon公司；BQ50-1J蠕動泵：保定蘭格恒流泵有限公司；高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）：美國安捷倫公司。

1.3 方法

1.3.1 培養(yǎng)方法

（1）種子活化：無菌竹簽轉(zhuǎn)接-80℃保藏甘油管菌液至250 mL茄子瓶斜面（裝量60 mL），在恒溫培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)24 h。

（2）種子培養(yǎng)：培養(yǎng)好的茄子瓶斜面加50 mL無菌水洗菌苔，倒入裝有玻璃珠的無菌三角瓶（250 mL三角瓶，種子培養(yǎng)基裝量50 mL）中，輕輕搖勻，接種4 mL菌懸液，并在37℃、250 r/min培養(yǎng)24 h。

（3）搖瓶發(fā)酵：250 mL三角瓶，裝量25 mL。接種3 mL種子培養(yǎng)液于搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中，并在37℃、250 r/min培養(yǎng)約44 h。

（4）10 L罐培養(yǎng)：基料5 L，接種量6%（V/V），通氣量600 L/h，轉(zhuǎn)速600 r/min，罐壓控制在0.03 MPa，37℃培養(yǎng)32 h左右。

1.3.2 分析方法

（1）生物量的測定：由于是濁液發(fā)酵，為了較快得到生物量的數(shù)據(jù)，采取細(xì)菌計(jì)數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，并建立了顯微計(jì)細(xì)胞數(shù)（x）與平板計(jì)數(shù)（y，CFU/mL）之間的關(guān)系（y=0.350 1x-8.805 6，R2=0.986 8）。

（2）氨基酸測定：發(fā)酵液8 000 r/min離心10 min，取0.5mL上清液，加入等體積的磺基水楊酸，振蕩搖勻，再4℃、12 000 r/min離心15 min，用0.02 mol/L HCl進(jìn)行適當(dāng)稀釋，0.22 μm膜過濾，濾液用氨基酸分析儀檢測氨基酸含量[8]。

（3）高效液相色譜測定桿菌肽含量：取預(yù)處理后的上清液1 mL，加入體積分?jǐn)?shù)50%乙醇4 mL，振蕩搖勻，再10 000 r/min離心10 min，上清液經(jīng)0.22 μm膜過濾后，備用。HPLC測定桿菌肽效價方法按文獻(xiàn)進(jìn)行[9]。

（4）過氧化氫酶活測定：a.樣品保存與洗滌：發(fā)酵中期進(jìn)行周期取樣，液氮凍存后備用。保留5mL發(fā)酵液離心（4℃、8 000 r/min、10 min）后的菌體沉淀，加入4 mL磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）緩沖液（pH 7.0），充分振蕩搖勻，洗滌，再次離心（4℃、8 000 r/min、10 min）。重復(fù)此操作6次，保留細(xì)胞沉淀。b.提取過氧化氫粗酶液：洗滌后的細(xì)胞加入PBS緩沖液（pH 7.0），定容至5 mL，充分振蕩搖勻。然后將菌懸液置于超聲細(xì)胞破碎儀超聲破碎，并進(jìn)行冰浴處理。工作條件：功率60%，超聲工作4 s，間歇5 s，超聲時間15min。待超聲細(xì)胞完成后，取出離心管離心（4℃、8 000 r/min、10 min），上清液即為過氧化氫粗酶液提取液。c.酶活測定：取10 mL試管2支，編號0和1，并按表1順序依次加入試劑[10]。

表1 過氧化氫酶活測定體系Table 1 Determination system of catalase activity

對照組加入0.3 mL蒸餾水，在波長240 nm處調(diào)零。實(shí)驗(yàn)組加入0.3 mL 0.1 mol/L的H2O2，測定吸光度值，間隔15 s讀數(shù)1次，記錄數(shù)據(jù)3～5 min。酶活定義：1 min內(nèi)A240nm減少0.1所用的酶量為1個酶活單位（U）。

式中：VT為破碎后過氧化氫酶總體積，mL；V1為用于測定的過氧化氫酶體積，mL；FW為破碎后胞內(nèi)蛋白質(zhì)量，g；0.1為A240nm每下降0.1為1個酶活單位，U；t為反應(yīng)時間，min。

本實(shí)驗(yàn)中樣品蛋白（FW）為粗酶液中的蛋白含量，采用考馬斯亮藍(lán)G-250方法測定粗酶液蛋白含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵過程中胞外氨基酸濃度的時序變化

桿菌肽是一種非核糖體合成酶催化合成的12環(huán)肽次級代謝產(chǎn)物，前體氨基酸的種類主要有Asp、Glu、Cys、Val等[11]。氨基酸不僅為桿菌肽合成的前體分子，有些氨基酸（如Cys）還可能具有緩解氧化脅迫的功能。因此，有必要對發(fā)酵過程中相關(guān)前體氨基酸進(jìn)行檢測。

圖1 地衣芽孢桿菌在10 L罐發(fā)酵過程中胞外氨基酸含量及桿菌肽效價的變化Fig.1 Change of the extracellular amino acids content and bacitracin titreB.licheniformisLC fermentation in 10 L fermentor

由圖1可知，在發(fā)酵過程中Glu、Asp、Leu、Phe、Lys和His的含量持續(xù)上升，在放罐時（32 h）分別達(dá)到626 mg/L、140mg/L、480mg/L、933mg/L、394mg/L和151mg/L。而Cys和Val在26 h分別達(dá)到峰值134 mg/L和196 mg/L之后，便開始迅速下降，至32 h分別下降了81.1%（74 mg/L）和30.7%（150 mg/L），而且發(fā)酵過程中Val含量始終高于Cys近50%以上。30 h桿菌肽效價達(dá)到峰值960 U/mL，后開始降解。這可能與Cys在28 h后處于低水平狀態(tài)不足以維持桿菌肽合成有關(guān)。

2.2 單因素?fù)u瓶添加抗壞血酸與半胱氨酸對桿菌肽合成的影響

在桿菌肽高密度發(fā)酵過程中，溶氧是限制性因素之一。溶氧不足而導(dǎo)致的“酸脅迫效應(yīng)”使細(xì)胞生長緩慢，發(fā)酵周期延長，桿菌肽的合成受到限制[12]。加強(qiáng)供氧夠有效的解決以上問題，曾新年等[3]在300 r/min和600 L/h發(fā)酵條件下流加雙氧水有效地緩解了溶解氧不足的問題，促進(jìn)了桿菌肽的合成效率，但發(fā)酵周期過長的問題沒有解決。本實(shí)驗(yàn)條件下（轉(zhuǎn)速600 r/min和通風(fēng)600 L/h）發(fā)酵周期縮短了約10 h，放罐效價也略高于曾新年的報(bào)道[3]。但是也出現(xiàn)了著新的矛盾：發(fā)酵中后期細(xì)胞便開始自溶，這勢必會影響桿菌肽的合成效率。VOIGT B等[5]報(bào)道了地衣芽胞桿菌在快速生長過程存在嚴(yán)重的氧化脅迫效應(yīng)。因此，在實(shí)驗(yàn)條件下（高通風(fēng)和高轉(zhuǎn)速）促使地衣芽胞桿菌的生長代謝的同時，很可能也加劇了細(xì)胞清除高活性氧自由基的負(fù)擔(dān)，并對細(xì)胞造成了氧化脅迫，而突出的氧化脅迫很可能是使細(xì)胞活力急劇而持續(xù)的下降、自溶的內(nèi)在因素。而微生物生長代謝過程中也特異性的存在谷胱甘肽和半胱氨酸等非酶解氧化應(yīng)激的形式，這對于清除高活性氧自由基也可起到積極作用，因此，在搖瓶水平研究了VC和半胱氨酸對地衣芽孢桿菌合成桿菌肽的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 抗壞血酸（A）及半胱氨酸（B）對出發(fā)菌株搖瓶發(fā)酵合成桿菌肽的影響Fig.2 Effects of VC(A)and Cys(B)addition on bacitracin production byB.licheniformis LC in shake flask fermentation

由圖2A可知，單因素?fù)u瓶添加VC或半胱氨酸都能促進(jìn)地衣芽孢桿菌合成桿菌肽，添加0.2%抗壞血酸時，桿菌肽效價最高為821 U/mL，比對照提高了20.7%（680 U/mL）。0.4%和0.6%添加量都促進(jìn)了桿菌肽合成，但是不如0.2%的添加量明顯，然而0.8%的添加量卻抑制桿菌肽的合成，只有對照組的97.5%（663 U/mL）。另外，VC添加量越多，發(fā)酵液的pH值反而越低（資料未顯示），這可能與過量的抗壞血酸被氧化、增強(qiáng)的供氧矛盾導(dǎo)致細(xì)胞能量供給不足以及溢流酸代謝加劇有關(guān)[13]。

由圖2B可知，當(dāng)添加0.4%半胱氨酸時，桿菌肽效價達(dá)到了880 U/mL，比對照提高了29.4%，比VC添加的最高值（821 U/mL）提高了7.2%，但是繼續(xù)增加Cys的濃度（0.6%和0.8%）并沒有進(jìn)一步提高桿菌肽的效價，但沒有VC組添加抑制桿菌肽合成的現(xiàn)象。同樣的，放瓶pH也隨著Cys添加量的增多而降低（資料未顯示）。

2.3 單因素?fù)u瓶添加抗壞血酸和半胱氨酸對過氧化氫酶

活的影響

抗壞血酸（VC）是酸性多羥基化合物，而半胱氨酸含有巰基（-SH），都具很強(qiáng)的抗氧化性，可保護(hù)細(xì)胞免于活性氧自由基的威脅[14]。為了考察添加Cys或VC是否能夠促進(jìn)桿菌肽的合成，對發(fā)酵過程的胞內(nèi)過氧化氫酶活性進(jìn)行了檢測，結(jié)果見圖3。

圖3 搖瓶添加抗壞血酸或半胱氨酸對出發(fā)菌株胞內(nèi)過氧化氫酶活的影響Fig.3 Effects of VC or Cys addition on the intracellular catalase activity of strain LC in shake flask fermentation

由圖3可知，隨著搖瓶發(fā)酵的進(jìn)行，對照組和實(shí)驗(yàn)組（添加Cys或VC）過氧化氫酶活力均呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢。26 h分別達(dá)到13.8 U/（g·min）（對照組）、9.6 U/（g·min）（Cys組）和8.2 U/（g·min）（VC組）。但是，實(shí)驗(yàn)組酶活較對照組分別降低了43.8%（Cys組）和68.3%（VC），說明了添加VC或Cys確實(shí)起到了抗氧化脅迫的作用，它們分擔(dān)了胞內(nèi)過氧化氫酶的氧自由基清除負(fù)擔(dān)。

雖然半胱氨酸的還原性（氧自由基去除能力）沒有VC強(qiáng)[15]，但是Cys是桿菌肽的前體氨基酸之一，又是限制性因素（圖1），而且添加Cys相比VC更能有效的提高桿菌肽效價（圖2）。因此，提高桿菌肽發(fā)酵菌株內(nèi)源性Cys的供給效率可能會更有效的促進(jìn)效價合成。

2.4 半胱氨酸合成加強(qiáng)型基因工程菌株在10 L罐上進(jìn)行發(fā)酵驗(yàn)證

菌株LC（對照組）和CY（實(shí)驗(yàn)組）在10 L發(fā)酵罐上的發(fā)酵特性，如：桿菌肽效價、生物量、過氧化氫酶活和Cys含量的變化如圖4所示。

圖410 L罐發(fā)酵過程中地衣芽孢桿菌LC和CY生物量、Cys、過氧化氫酶和桿菌肽產(chǎn)量的變化Fig.4 Change of cell growth,Cys,catalase and bacitracin production in a 10 L bioreactor by strain LC and CY

由圖4可知，對照組和實(shí)驗(yàn)組桿菌肽效價變化趨勢幾乎一致，分別達(dá)到最高效價960 U/mL（30 h）和1 090 U/mL（28 h），后者桿菌肽效價比對照提高了13.5%。細(xì)胞生長趨勢幾乎一致，分別在26 h（實(shí)驗(yàn)組，84×109CFU/mL）和24 h（對照組，77×109CFU/mL）達(dá)到峰值。但是，CY菌株自溶時間比對照延后了2 h。對過氧化氫酶活力和Cys含量而言，20h之前Cys的含量幾乎一樣，但是進(jìn)入主發(fā)酵期（20 h）后，實(shí)驗(yàn)組Cys含量明顯高于出發(fā)菌株，分別到達(dá)峰值213.3mg/L（24h）和133.6 mg/L（26 h），比對照提高了近60%。

過氧化氫酶活變化與搖瓶實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，呈現(xiàn)持續(xù)上升的趨勢，由于發(fā)酵罐培養(yǎng)過程中氧的供給效率遠(yuǎn)高于搖瓶培養(yǎng)過程，氧自由基生成效率以及對其去除所需要的過氧化氫酶也要遠(yuǎn)高于搖瓶水平，因此過氧化氫酶活明顯高于搖瓶80%～120%。另外，CY菌株相比LC菌株過氧化氫酶活力（14～32 h）降低了15%～40%。由于半胱氨酸既是桿菌肽合成的前體氨基酸之一，同時其分子中的巰基（-SH）又是消除氧自由基的活性基團(tuán)[16]，因此，桿菌肽合成對Cys前體分子的需求與氧自由基去除（抗氧化脅迫）之間存在競爭性關(guān)系。CY菌株增強(qiáng)了Cys的合成，更好地滿足了細(xì)胞對兩者的生理需求，顯著維持了細(xì)胞活性（生物量提高以及細(xì)胞自溶延后2 h）、促進(jìn)了桿菌肽合成效率。另外，實(shí)驗(yàn)組的桿菌肽合成時間（28 h）比對照減少了2 h，可能與高活性細(xì)胞生長代謝更快速地消耗了營養(yǎng)物質(zhì)，致使其在后期不足有關(guān)。這也為進(jìn)一步的桿菌肽補(bǔ)料發(fā)酵研究提供了較為明確的補(bǔ)料窗口信息。

3 結(jié)論

由地衣芽孢桿菌發(fā)酵合成桿菌肽過程中的上清液前體氨基酸的含量變化，確定了Cys是限制氨基酸之一。另外，在高密度耗氧發(fā)酵過程中，尤其是高通風(fēng)量和高轉(zhuǎn)速培養(yǎng)條件下，活性氧自由基生成以及其對細(xì)胞造成的氧化脅迫是限制桿菌肽高效合成的限制性因素之一。發(fā)酵中期添加Cys可促進(jìn)活性氧自由基的清除，但是內(nèi)源性Cys作為前體氨基酸參與桿菌肽分子合成與參與自由基去除反應(yīng)之間的矛盾不可調(diào)和。菌體為了保持其細(xì)胞活性而存活的生理需求很可能使Cys處于加速參與自由基去除系統(tǒng)的狀態(tài)，這樣就對其“前體氨基酸”的功能產(chǎn)生了競爭性抑制。半胱氨酸加強(qiáng)型工程菌株通過提高Cys的供給效率既滿足了細(xì)胞清除自由基、減弱氧化脅迫效應(yīng)的需求，又加強(qiáng)了Cys參與桿菌肽合成的效率，可謂是一舉兩得。同時，發(fā)酵后期工程菌株桿菌肽效價不再上升以及細(xì)胞自溶可能與發(fā)酵后期碳源不足有關(guān)，這也提供了較為準(zhǔn)確的補(bǔ)料窗口信息，將在以后的研究中進(jìn)行補(bǔ)料優(yōu)化。

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Q815

0254-5071（2017）05-0113-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.05.024

2017-01-22

湖北大學(xué)綠康生物工程研究所開放課題（2015LBIHU603）

劉道奇（1991-），男，碩士研究生，主要從事農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究工作。

*通訊作者：王志（1971-），男，副教授，博士，主要從事微生物工程研究工作。