紙葡萄穗霉降解β-胡蘿卜素的產香研究

段焰青，杜剛，黨立志，曾熠程，李青青*

（1.云南中煙工業有限責任公司技術中心，云南昆明650231；2.云南民族大學民族藥資源化學國家民族事務委員會-教育部重點實驗室，云南昆明650500；3.西南林業大學生命科學學院，云南昆明650224）

紙葡萄穗霉降解β-胡蘿卜素的產香研究

段焰青1，杜剛2，黨立志1，曾熠程1，李青青3*

（1.云南中煙工業有限責任公司技術中心，云南昆明650231；2.云南民族大學民族藥資源化學國家民族事務委員會-教育部重點實驗室，云南昆明650500；3.西南林業大學生命科學學院，云南昆明650224）

從采自云南昆明的22份不同陳化時間的煙草樣品中篩選到6株可降解β-胡蘿卜素的真菌。菌株YNCA9037可降解β-胡蘿卜素，獲得具甜木香味的發酵產物，經菌落形態、顯微形態及轉錄間隔區（ITS）序列分析進行菌株分類鑒定，菌株YNCA9037初步鑒定為紙葡萄穗霉（Stachybotrys chartarum）。對菌株YNCA9037降解β-胡蘿卜素的產香條件進行初步研究，其較佳產香的條件為：pH 6.5，發酵溫度28℃，發酵時間72 h，β-胡蘿卜素添加量0.2%。菌株YNCA9037降解β-胡蘿卜素的發酵產物經氣質聯用（GC-MS）法分析，檢測到致香物質β-環檸檬醛和β-紫羅蘭酮。

紙葡萄穗霉；β-胡蘿卜素；菌株鑒定；致香物質

DUAN Yanqing1,DU Gang2,DANG Lizhi1,ZENG Yicheng1,LI Qingqing3*
(1.Technology Center,China Tobacco Yunnan Industrial Co.,Ltd.,Kunming 650231,China;2.Key Laboratory of Chemistry in Ethnic Medicinal Resources,State Ethnic Affairs Commission&Ministry of Education,Kunming,650500,China;3.College of Life Science, Southwest Forestry University,Kunming 650224,China)

類胡蘿卜素是一大類自然界廣泛分布的四萜類化合物[1]，它作為生理抗氧化劑，具有抗腫瘤、抗衰老等功效，由于其無毒無害且著色能力良好，也作為食品著色劑使用[2-4]。類胡蘿卜素降解可產生β-紫羅蘭酮、二氫獼猴桃內酯和β-大馬酮等致香物質[5-6]，因這類致香物質具有較低的感官閾值，是許多香料的特征香味[7]，然而在天然材料中這類香味物質含量極低，且提取成本昂貴。近年來一些研究者嘗試通過酶或微生物體系模擬類胡蘿卜素的自然降解獲得新型香料[8]。NINGRUM A等[9]從七葉蘭葉片中得到的粗酶降解β-胡蘿卜素，獲得β-紫羅蘭酮。楊雪鵬等[10]以霍氏腸桿菌（Enterobacter hormaechei）A20降解類胡蘿卜素可產生香味物質。SáNCHEZ-CONTRERAS A等[11]以地絲菌屬菌株（Geotrichumsp.）和芽孢桿菌（Bacillussp.）兩株菌混菌培養，降解葉黃素產生紫羅蘭酮和紫羅蘭醇等有煙草特征香味的物質。ZELENA L等[12]以來源于蒜頭狀小皮傘的過氧化物酶降解葉黃素得到3-羥基-β-紫羅蘭酮和3-羥基-α-紫羅蘭酮，降解β-胡蘿卜素得到β-紫羅蘭酮、β-環檸檬醛和二氫獼猴桃內酯等致香物質。

葡萄穗霉屬殼霉目、杯霉科真菌，是廣泛存在于自然界的霉菌[13]，同時是很重要的植物病原菌[14]。目前，利用微生物降解類胡蘿卜素產香尚未實現大規模應用，本實驗從云南昆明的22份不同陳化時間的煙草樣品中篩選到6株可降解β-胡蘿卜素的真菌，并對其中可降解β-胡蘿卜素菌株YNCA9037進行分子生物學鑒定，對菌株YNCA9037降解β-胡蘿卜素的產香條件進行初步研究。通過本研究為微生物降解類胡蘿卜素獲取致香物質提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株來源

云南昆明陳化1～3年的煙葉22份：由紅云紅河集團提供。

1.1.2 培養基

內生真菌活化采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，定容至1 L，pH值6.8。121℃滅菌25 min。

β-胡蘿卜素降解篩選培養基：馬鈴薯200g，葡萄糖20g，β-胡蘿卜素0.2%，瓊脂20 g，定容至1 L，pH值6.8。121℃滅菌25 min。

液體發酵培養基：NaNO32 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，K2HPO41g，FeSO4·7H2O0.01g，KCl0.5g，β-胡蘿卜素0.2%，瓊脂20 g，定容至1 L，pH值6.8。121℃滅菌25 min。

1.1.3 化學試劑

β-胡蘿卜素（純度30%）：德國巴斯夫公司；瓊脂粉：北京奧博星生物技術有限公司；二氯甲烷（分析純）：天津市福晨化學試劑廠；其他試劑采購自上海國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

Tanon 2500凝膠成像系統：上海天能科技有限公司；TGL-15B高速冷凍離心機：上海安亭科學儀器廠；5331型PCR儀：德國Eppendorf股份公司；Nikon ECLIPSE E200顯微鏡：北京冠普佳科技有限公司；ScoutⅡ電子天平：奧豪斯國際貿易上海有限公司；SW-CJ-ZFD無菌操作臺：蘇凈集團安泰公司；LDZX-40BI立式自動電熱壓力蒸汽滅菌鍋：上海申安醫療器械廠；ZHWY-2102恒溫培養振蕩器：上海智城分析儀器制造有限公司；HP-900隔水式恒溫培養箱：上海一恒科技有限公司；ISQ氣相色譜-質譜聯用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）儀：賽默飛世爾科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 β-胡蘿卜素儲備液制備

將β-胡蘿卜素（30%）5 g溶于10 mL二氯甲烷中，然后加入1 g Tween-80進行乳化。將二氯甲烷自然揮發，再加入100 mL無菌蒸餾水混合得乳濁液儲備待用。

1.3.2 降解β-胡蘿卜素目標菌株的平板篩選

以三點法對待篩選菌株進行純化，純化菌株接種于斜面，再接種于β-胡蘿卜素降解篩選培養基上，能使培養基褪色的菌株為待選菌株。

1.3.3 降解β-胡蘿卜素產香菌株的篩選

將待選菌株斜面接入發酵培養基中培養，置于恒溫培養振蕩器，180r/min、30℃條件下發酵5d，每株菌以相同的條件不添加底物發酵作空白對照。發酵液過濾后用二氯甲烷1∶1萃取為待檢測樣品。

1.3.4 菌株YNCA9037的形態鑒定

將菌株YNCA9037接種于平板培養基，28℃恒溫條件下培養3 d，記錄形態、干濕、顏色等菌落特征。

顯微特征觀察：插片法培養，把滅過菌的蓋玻片45度角插入PDA平板中，將菌種接種于蓋玻片的基部，使真菌菌絲迎著培養基表面附著于蓋玻片上，28℃恒溫條件下培養3～4 d后，用鑷子輕輕取出蓋玻片，置于載玻片上制成臨時裝片進行顯微形態觀察，記錄其菌絲、孢子囊、孢子梗、分生孢子形態特征及與營養體之間的著生關系等。根據魏景超[15]《真菌鑒定手冊》，將真菌分類至綱、目、科、屬。1.3.5菌株YNCA9037的分子鑒定

菌株YNCA9037脫氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid，DNA）提取：活化斜面菌種接種于100mLPDA液體培養基，28℃條件下培養4 d，取5 mL發酵液于12 000 r/min條件下離心10 min，收集菌絲體，以液氮凍融-十六烷基三甲基溴化銨（hexadecyltrimethy ammonium bromide，CTAB）法提取真菌DNA。聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）反應體系（25 μL）：DNA Tax MIX，10 μL；引物ITS4 5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′，2 μL；引物ITS5 5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′，2 μL；模板DNA，2μL；純凈水，9μL。PCR反應程序：94℃預變性3min；94℃變性30 s；50℃退火30 s；72℃延伸1.5 min；72℃末端延伸10 min；循環30次；4℃保存。PCR產物電泳檢測：取0.75 g瓊脂糖于50 mL 0.5×四溴乙烷（tetrabromoethane，TBE）緩沖液中，加熱煮沸2min，稍冷后加入1.5μLGoldView染色液，搖勻倒膠。將所得的PCR擴增產物和Marker分別取5 μL到瓊脂糖凝膠上，在0.5×TBE緩沖液中電泳，電壓80 V。電泳結束后凝膠成像儀系統記錄。PCR擴增產物的純化及序列測定經瓊脂糖凝膠電泳檢測后送昆明碩擎生物技術有限公司測序。

所測序列在GeneBank基因庫中進行Blast比對，用MEGA7.0進行系統發育樹的分析構建。

1.3.6 菌株YNCA9037產香發酵條件研究

培養基初始pH：將液體培養基的pH分別調至5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5，在28℃、180r/min條件下振蕩培養72h，考察培養基初始pH對菌株YNCA9037降解β-胡蘿卜素產香的影響。

培養溫度：將接種后的液體發酵培養基（pH 6.5）分別置于20℃、25℃、28℃、32℃、35℃、40℃條件下，180 r/min振蕩培養72 h，考察培養溫度對菌株YNCA9037降解β-胡蘿卜素產香的影響。

培養時間：將接種好的液體培養基（pH 6.5）在28℃、180r/min條件下分別培養48h、72h、96h、120h、144h、168h、192 h，考察培養時間對菌株YNCA9037降解β-胡蘿卜素產香的影響。

β-胡蘿卜素的添加量：將接種好的液體培養基（pH 6.5），在28℃、180 r/min條件下振蕩培養72 h，β-胡蘿卜素添加量為0.05%、0.10%、0.20%、0.40%、0.60%、1.00%，考察β-胡蘿卜素的添加量對菌株YNCA9037降解β-胡蘿卜素產香的影響。

發酵產物由10名專業人士對產香質量進行評價，優選出較好的發酵方式。

1.3.7 菌株YNCA9037發酵樣品香味成分的GC/MS分析

菌株YNCA9037發酵β-胡蘿卜素的50 mL樣品，先進行抽濾，再加入50 mL二氯甲烷萃取，進行氣相色譜-質譜（GC-MS）聯用分析檢測。

氣相色譜條件：TR-1MS色譜柱（30 m×0.25 mm× 0.25 μm）；載氣：氦氣（He）（純度99.999%）；升溫程序：60℃保持1 min，以10℃/min的速度升至120℃，保持1 min，然后以2℃/min的速度升至140℃，保持1 min，再以5℃/min的速度升至200℃，保持1 min；柱流量：0.8 mL/min；進樣量1 μL；進樣口溫度250 ℃；分流比30∶1，溶劑延遲3 min。

質譜條件：電子電離（electron ionization，EI）源，電離電壓70 eV；離子源溫度260℃；掃描范圍30～500 m/z。

定性方法：各香氣組分質譜圖經計算機美國國家標準技術研究所（national institute of standards and technology，NIST）譜庫檢索及相關資料的分析，對香氣成分進行分析比對定性。

2 結果與分析

2.1 β-胡蘿卜素降解菌株的篩選

從篩選平板上發現可產生明顯透明圈的6株菌，分別為菌株YNCA9013、YNCA9022、YNCA9023、YNCA9031、YNCA9037和YNCA9043。將6株菌接種于含類胡蘿卜素的液體培養基中，28℃發酵96 h后6株菌都可使液體培養基褪色。菌株YNCA9013、YNCA9022的發酵液有果香味，但味道較淡；菌株YNCA9037產生較濃的甜木香味；其余菌株發酵液沒有香味，未接種菌株的對照樣發酵前后沒有味道變化。因此，對菌株YNCA9037進行分子生物學鑒定。

2.2 類胡蘿卜素降解菌株的分類鑒定

菌株YNCA9037形態特征如圖1所示。由圖1可知，菌株YNCA9037菌落大，呈毛絮狀，黑褐色，邊緣白色，背面黑褐色；菌絲體不發達，菌絲光滑透明、有隔；孢子梗和孢子囊為黑色或褐色，分生孢子簇生于孢子梗頂端的瓶形小梗上，初步鑒定YNCA9037菌株為葡萄穗霉屬（Stachybotrys）。

以菌株YNCA9037提取的DNA為模板，ITS進行PCR擴增如圖2所示，表明擴增片段在500～750 bp。測序結果表明，菌株YNCA9037的ITS序列長566 bp。測序結果在GenBank中進行同源性比對，采用MEGA7.0軟件，以領接法構建菌株YNCA9037的系統發育樹，結果見圖3。由圖3可知，YNCA9037與Stachybotrys聚為一大簇，與紙葡萄穗霉菌株Stachybotrys chartarumstrain CBS 136172聚為一簇，同源性為99%，初步鑒定菌株YNCA9037為紙葡萄穗霉（Stachybotrys chartarum）。

圖1 菌株YNCA9037的菌落（a）及顯微（b）形態Fig.1 Colony(a)and microscopic(b)morphology of strain YNCA9037

圖2 菌株YNCA9307的ITS序列PCR擴增產物檢測結果Fig.2 Detection results of ITS sequence PCR amplified products strain YNCA9307

圖3 菌株YNCA9037基于ITS序列N-J法構建的系統發育樹Fig.3 Phylogenetic tree of strain YNCA9037 based on ITS sequence with N-J method

2.3 菌株YNCA9037產香發酵條件研究

培養基初始pH實驗中pH 6.5發酵液香味最好，表明最適宜的初始pH為6.5；培養溫度實驗中28℃發酵液香味最好，溫度過低香味較淡，溫度高于32℃產生異味，表明最適宜的發酵溫度為28℃；培養時間實驗中72 h發酵液香味最好，超過72 h香味逐漸變淡，表明最適宜的發酵時間為72 h；β-胡蘿卜素添加量＞0.1%時香味較淡，添加量為0.2%與0.4%的香味相當，β-胡蘿卜素添加量超過0.6%時產生異味，表明最適宜的β-胡蘿卜素添加量為0.2%。

2.4 菌株YNCA9037發酵樣品香味成分的GC/MS分析

紙葡萄穗霉菌株YNCA9037發酵β-胡蘿卜素產生甜木香味，對該樣品進行GC-MS分析，結果見圖4。由圖4可知，發酵樣品檢測到保留時間9.86 min的峰為β-環檸檬醛，保留時間18.54 min的峰為β-紫羅蘭酮。β-環檸檬醛和β-紫羅蘭酮為β-胡蘿卜素降解產物，β-環檸檬醛具有果香和花香香氣，香氣類似紫蘭酮和鳶尾，并帶有清涼和木香，稍有油膩的氣息，β-紫羅蘭酮香氣較為柔，木香稍重，具有覆盆子的香味，稀釋后有類似紫羅蘭花的香味。但發酵產物含量較低，含有一定刺激性氣味，還需進一步優化發酵條件。

圖4 菌株YNCA9037發酵樣品香氣成分GC-MS分析總離子流色譜圖Fig.4 Total ion chromatogram of aroma components in the fermentation samples of strain YNCA9037 analysis by GC-MS

3 結論

本實驗從采自云南省昆明市的22份不同陳化程度的煙草樣品篩選到6株可降解類胡蘿卜素的真菌，經菌落及菌體的顯微形態觀察比對，初步鑒定為葡萄穗霉屬菌株，結合ITS序列分析對菌株進行分類鑒定，初步鑒定菌株YNCA9037為紙葡萄穗霉（Stachybotrys chartarum）。對其降解β-胡蘿卜素進行初步發酵條件研究，最適宜的初始pH為6.5，最適宜的發酵溫度為28℃，最適宜的發酵時間為72 h，最適宜的β-胡蘿卜素添加量為0.2%。紙葡萄穗霉菌株YNCA9037發酵樣品經GC-MS分析，檢測到β-環檸檬醛和β-紫羅蘭酮等致香物質。ZORN H等[16]的研究中篩選出可降解類胡蘿卜素的2株酵母和8株絲狀真菌，β-胡蘿卜素的降解產物中也發現β-紫羅蘭酮和β-環檸檬醛等香味物質。本研究建立篩選降解β-胡蘿卜素菌株的方法，初步研究了紙葡萄穗霉降解β-胡蘿卜素的產香條件，為進行放大發酵和工業化生產新型香料提供了技術支持。

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TS201.3

0254-5071（2017）05-0105-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.05.022

2016-12-21

云南中煙工業有限責任公司項目（2015539200340277）；云南省科技廳項目（2015BA006）；云南省技術創新人才項目（2016HB009）；中國煙草總公司科技項目（110201402040）

段焰青（1974-），男，研究員，博士，研究方向為微生物香料。

*通訊作者：李青青（1976-），女，副教授，博士，研究方向為分子生物學。