響應(yīng)面法優(yōu)化芽孢桿菌CJPE209產(chǎn)角蛋白酶發(fā)酵培養(yǎng)基的研究

蔣彪，王常高，杜馨，林建國，蔡俊*

（湖北工業(yè)大學(xué)發(fā)酵工程教育部重點試驗室工業(yè)發(fā)酵湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北武漢430068）

響應(yīng)面法優(yōu)化芽孢桿菌CJPE209產(chǎn)角蛋白酶發(fā)酵培養(yǎng)基的研究

蔣彪，王常高，杜馨，林建國，蔡俊*

（湖北工業(yè)大學(xué)發(fā)酵工程教育部重點試驗室工業(yè)發(fā)酵湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北武漢430068）

采用響應(yīng)面法對芽孢桿菌（Bacillussp.）CJPE209產(chǎn)角蛋白酶的發(fā)酵培養(yǎng)基組分進(jìn)行優(yōu)化。在前期單因素優(yōu)化的基礎(chǔ)上利用Plackett-Burman試驗設(shè)計篩選出影響產(chǎn)酶的2個顯著性因素：羽毛粉、蔗糖。在此基礎(chǔ)上，采用最陡爬坡試驗確定中心復(fù)合試驗的中心點，然后對其他不顯著因素進(jìn)行最低添加量試驗以降低生產(chǎn)成本和簡化培養(yǎng)基組分。利用中心復(fù)合試驗，得到預(yù)測最佳培養(yǎng)基組成為羽毛粉5.6 g/L、蔗糖13.6 g/L、尿素5.0 g/L、KH2PO40.4 g/L、MgSO41.44 g/L、CaCl21.1 g/L、NaCl 5.0 g/L，預(yù)測角蛋白酶酶活為501.9 U/mL。用預(yù)測最佳培養(yǎng)基來進(jìn)行發(fā)酵驗證試驗，結(jié)果實際角蛋白酶酶活為503.5 U/mL，表明模型能較好的預(yù)測發(fā)酵后酶活。

芽孢桿菌；角蛋白酶；響應(yīng)面法；培養(yǎng)基優(yōu)化

JIANG Biao,WANG Changgao,DU Xin,LIN Jianguo,CAI Jun* (Key Laboratory of Fermentation Engineering(Ministry of Education),Hubei Provincial Cooperative Innovation Center of Industrial Fermentation,Hubei University of Technology,Wuhan 430068,China)

角蛋白是一種不溶于水、鹽、稀酸或稀堿，自然界中廣泛存在的硬質(zhì)蛋白，其蛋白結(jié)構(gòu)中的多肽多由二硫鍵、氫鍵和疏水作用的其他化學(xué)鍵高度交聯(lián)形成較為穩(wěn)定的空間結(jié)構(gòu)[1]。角蛋白主要來源于外胚層細(xì)胞，包括皮膚和皮膚的衍生物（如毛發(fā)、羽毛、鱗、甲、角質(zhì)、喙等），分為α-角蛋白和β-角蛋白兩種[2]。羽毛作為養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的副產(chǎn)物年產(chǎn)量巨大，其中粗蛋白含量約占羽毛本身的85%以上，且蛋白多為角蛋白[3-5]。通過角蛋白酶降解羽毛得到小分子多肽和氨基酸，可以運用于飼料行業(yè)和醫(yī)療保健產(chǎn)品[6-7]。另外，角蛋白酶廣泛應(yīng)用于肥料、洗滌工業(yè)和皮革行業(yè)等領(lǐng)域[8-10]。

目前，在角蛋白酶的發(fā)酵研究中，主要集中在對發(fā)酵條件和發(fā)酵培養(yǎng)基這兩個方面進(jìn)行優(yōu)化，研究方法上主要是用到單因素、正交和響應(yīng)面試驗對其進(jìn)行優(yōu)化[11]。由于單因素試驗無法考慮到各因素之間的交互作用，正交試驗無法獲得全面可靠的水平組合，但響應(yīng)面試驗法不僅可以同時對影響生物量的各因素和各因素的相互作用進(jìn)行比較和優(yōu)化，還可以快速確定出各因素最優(yōu)水平，減少試驗次數(shù)，節(jié)約時間。RAMNANI P等[12]采用Plackett-Burman法選出影響地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）RG1產(chǎn)角蛋白酶的3個顯著因素，并進(jìn)一步通過中心復(fù)合試驗得到最優(yōu)產(chǎn)酶培養(yǎng)基，使優(yōu)化后酶活提高3.5倍。THYS R C S等[13]采用響應(yīng)面法對微桿菌（Microbacteriumsp.）kr10產(chǎn)角蛋白酶的發(fā)酵過程進(jìn)行優(yōu)化，最高酶活達(dá)到202.7 U/mL。ANBU P等[14]以Box-Behnken試驗設(shè)計對Scopulariopsis brevicaulis產(chǎn)角蛋白酶培養(yǎng)基及條件進(jìn)行優(yōu)化，得到合適的產(chǎn)酶培養(yǎng)基組成及培養(yǎng)條件。

本研究以前期實驗室篩選得到的一株芽孢桿菌（Bacillussp.）CJPE209作為出發(fā)菌株，在前期單因素優(yōu)化的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法對其發(fā)酵培養(yǎng)基組分進(jìn)行優(yōu)化，提高酶活，為后期大規(guī)模生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

實驗室自行篩選得到的一株芽孢桿菌（Bacillussp.）CJPE209：保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，菌種保藏編號為CCTCC M 2015734。

1.1.2 試劑

羽毛粉：市售；50 mg/mL水溶性角蛋白：東京化成工業(yè)株式會社；福林酚試劑（生物試劑）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，牛肉膏5 g/L，NaCl 5 g/L，瓊脂粉20 g/L；

種子培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，牛肉膏5 g/L，NaCl 5 g/L；

初始發(fā)酵培養(yǎng)基：羽毛粉10g/L，尿素5g/L，蔗糖10g/L，KH2PO40.5 g/L，K2HPO4·3H2O 1 g/L，CaCl20.55 g/L，MgSO41.8 g/L，NaCl 5 g/L。

1.2 儀器與設(shè)備

SYNERGY2酶標(biāo)儀：Gene Company Limited；3K15冷凍離心機(jī)：德國Sigma公司；TGL-16C臺式離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器制品廠；SW-CJ-1D型單人凈化工作臺：蘇州凈化設(shè)備有限公司；ZHWY-2102C恒溫培養(yǎng)箱振蕩器：上海智城分析儀器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 角蛋白酶粗酶液的制備

將保藏的菌種接種到斜面培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)24 h以活化菌種。將活化好的菌種接種到種子培養(yǎng)基中37℃搖床振蕩培養(yǎng)14 h，待菌株生長達(dá)到最大速度。取2%（V/V）種子培養(yǎng)液接種于25 mL發(fā)酵培養(yǎng)基，搖床220 r/min振蕩培養(yǎng)48 h，取發(fā)酵液高速離心，得到上清液即為粗酶液。

1.3.2 角蛋白酶酶活測定方法

以1%的水溶性角蛋白（用0.01 mol/L的Tris-HCl緩沖液（pH9）稀釋）作為底物，參考YAMAMURA S等[15]的測定方法，向1mL底物中加入1mL的粗酶液，55℃水浴反應(yīng)20min后，加入2 mL 0.4 mol/L的三氯乙酸終止反應(yīng)，高速離心取1 mL上清液加入4 mL 0.4 mol/L的碳酸鈉溶液和1 mL福林酚試劑均勻混合，于40℃水浴反應(yīng)20 min，取反應(yīng)液200 μL于96孔板用酶標(biāo)儀在波長680 nm處檢測吸光度值；對照組使用先加入三氯乙酸滅活的酶液。

角蛋白酶酶活定義：在上述反應(yīng)體系中，吸光度值每增加0.01為一個酶活單位（U/mL）。酶活計算公式如下：

D=（A-B）×C×100

式中：A為試驗組吸光度值；B為對照組吸光度值；C為粗酶液稀釋倍數(shù)；D為角蛋白酶酶活，U/mL。

1.3.3 Plackett-Burman（PB）試驗設(shè)計

本研究選取N=12的試驗設(shè)計，選取前期單因素試驗中對酶活影響較大的7個因素，每個因素分為高（+）、低（-）兩水平，按照設(shè)計方案進(jìn)行12次試驗，以角蛋白酶酶活為響應(yīng)值，挑選出置信度＞95%的因素作為影響酶活的顯著因素。PB設(shè)計因素與水平見表1。

表1Plackett-Burman試驗設(shè)計因素與水平Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman experiments design g/L

1.3.4 最陡爬坡試驗

通過PB試驗得到影響角蛋白酶酶活的顯著因素，依據(jù)各因素的效應(yīng)值來選擇適當(dāng)步長，通過最陡爬坡試驗找到拐點，為下一步中心復(fù)合設(shè)計（central composite design，CCD）提供中心點數(shù)據(jù)。

1.3.5 最低添加量試驗

經(jīng)PB試驗得到影響粗酶液酶活的顯著因素和不顯著因素。為了降低成本、簡化培養(yǎng)基組分，選擇不顯著因素進(jìn)行合理步長的單因素試驗，確定不顯著因素組分的最小添加量。1.3.6中心復(fù)合設(shè)計（CCD）試驗

根據(jù)PB試驗和最陡爬坡試驗結(jié)果，通過2因素5水平的試驗來確定芽孢桿菌CJPE209產(chǎn)角蛋白酶的最佳培養(yǎng)基組分。CCD利用13組試驗，用軟件對試驗結(jié)果進(jìn)行回歸分析、方差分析和分析兩因素之間的相互作用，同時通過對試驗數(shù)據(jù)分析得到模型的多元函數(shù)和響應(yīng)面三維立體圖。然后用預(yù)測最佳培養(yǎng)基組分進(jìn)行發(fā)酵驗證試驗。試驗自變量水平的編碼值和實際值見表2。

表2 中心組合設(shè)計試驗因素與水平Table 2 Factors and levels of central composite design experiments

2 結(jié)果與分析

2.1 PB試驗

PB試驗結(jié)果如表3所示。對PB試驗結(jié)果進(jìn)行回歸分析和方差分析，結(jié)果見表4和表5。

表3Plackett-Burman試驗設(shè)計與結(jié)果Table 3 Design and results of Plackett-Burman experiments

表4Plackett-Burman試驗設(shè)計回歸分析Table 4 Regression analysis of the Plackett-Burman design

表5Plackett-Burman試驗設(shè)計方差分析Table 5 Variance analysis of Plackett-Burman design

由表4可知，α=0.05時羽毛粉和蔗糖的P值在95%的置信區(qū)間內(nèi)都＜0.05，表明羽毛粉和蔗糖都是影響CJPE209產(chǎn)角蛋白酶的顯著因素。通過效應(yīng)值知道蔗糖為正效應(yīng)，羽毛粉為負(fù)效應(yīng)。

由表5可知，此模型在95%的置信區(qū)間內(nèi)顯著，其決定系數(shù)R2=87.60%，說明回歸方程能解釋87.60%的試驗數(shù)據(jù)，同時證明此模型合理。

2.2 最陡爬坡試驗

根據(jù)PB試驗得到的結(jié)果，按照各因素的效應(yīng)值合理設(shè)計試驗的變化步長和最陡爬坡試驗，其步長及試驗結(jié)果見表6。

表6 最陡爬坡試驗設(shè)計與結(jié)果Table 6 Design and results of the steepest ascent tests

由表6可知，第1組到第3組角蛋白酶或逐漸升高，而從第4組酶活就開始下降，即第3組試驗為最陡爬坡的拐點，因此選擇第3組（蔗糖和羽毛粉的添加量分別為蔗糖12g/L、羽毛粉6 g/L）作為下一步中心復(fù)合試驗的中心點。

2.3 最低添加量試驗

由PB試驗結(jié)果可知，所選取的7個因素中尿素、KH2PO4、K2HPO4·3H2O、CaCl2和MgSO4為不顯著因素。將這5個因素做最低添加量試驗，結(jié)果見圖1。

由圖1a可知，酶活隨著尿素添加量的增加而升高，在尿素添加量為4 g/L時酶活達(dá)到最高為417 U/mL，當(dāng)尿素添加量繼續(xù)增加時粗酶液酶活開始下降，因此尿素的最佳添加量為4g/L；由圖1b可知，當(dāng)磷酸二氫鉀的添加量從0～0.4g/L逐漸增加時，粗酶液酶活隨磷酸二氫鉀的添加量的增加而提高，但磷酸二氫鉀的添加量繼續(xù)增加時，粗酶液酶活變化很小，因此磷酸二氫鉀的最佳添加量為0.4 g/L；由圖1c可知，磷酸氫二鉀的添加量從0～1 g/L逐漸增加時，粗酶液的酶活變化不大，為節(jié)約成本和簡化培養(yǎng)基，故磷酸氫二鉀選擇不添加到培養(yǎng)基；由圖1d可知，硫酸鎂的添加量在0～1.44 g/L的范圍內(nèi)逐漸增加，粗酶液的酶活在硫酸鎂添加量為1.44g/L達(dá)到最高為416g/L，因此硫酸鎂的最佳添加量為1.44 g/L；由圖1e可知，粗酶液的酶活隨氯化鈣的添加量的增加而增加，當(dāng)氯化鈣的添加量為1.1 g/L時，酶活達(dá)到最高為447U/mL。故選擇尿素、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、硫酸鎂和氯化鈣的添加量分別為4 g/L、0.4 g/L、0 g/L、1.44g/L和1.1 g/L。

圖1 最低添加量試驗設(shè)計與結(jié)果Fig.1 Design and results of the minimum addition experiments

2.4 中心復(fù)合設(shè)計（CCD）試驗

通過最陡爬坡試驗得到兩個影響酶活的顯著因素（蔗糖和羽毛粉）的中心復(fù)合試驗的中心點：蔗糖12 g/L、羽毛粉6 g/L。以這兩種顯著因素的濃度為自變量，角蛋白酶酶活為響應(yīng)值，進(jìn)行2因素5水平的中心復(fù)合設(shè)計試驗，試驗結(jié)果見表7。固定培養(yǎng)基其他組分為：尿素4 g/L、磷酸二氫鉀0.4g/L、硫酸鎂1.44g/L、氯化鈣1.1 g/L和氯化鈉5 g/L。

表7 中心復(fù)合試驗設(shè)計與結(jié)果Table 7 Design and results of central composite design

表8 響應(yīng)面二次模型方差分析Table 8 Variance analysis of response surface quadratic model

由表8可知，模型的P值遠(yuǎn)小于0.05，并且模型多元相關(guān)系數(shù)R2=99.41%，表明預(yù)測僅有0.59%的數(shù)據(jù)不能由該模型解釋。失擬項P＞0.05，不顯著，說明該模型無失擬現(xiàn)象。

通過Designexpert8.0.6對二次回歸系數(shù)的分析和計算得到A蔗糖和B羽毛粉對角蛋白酶酶活力影響的模型方程：

Y=493.9+38.75A-2.85B+24.37AB-20.98A2-17.73B2

通過軟件分析得到蔗糖和羽毛粉交互作用的三維立體圖見圖2。

圖2 蔗糖和羽毛粉交互作用對角蛋白酶酶活影響的響應(yīng)面和等高線Fig.2 Response surface plots and contour line of effects of interaction between sucrose and feather meal on keratinase activity

由圖2可知，當(dāng)羽毛粉添加量不變時，蔗糖添加量對酶活存在二次效應(yīng)，曲面呈拋物面，此響應(yīng)面圖呈典型的鐘罩狀，說明蔗糖和羽毛粉的交互作用比較明顯。根據(jù)上述分析及軟件計算，預(yù)測最佳組合為：蔗糖13.6 g/L和羽毛粉5.6 g/L。最終預(yù)測的最佳培養(yǎng)基為：蔗糖13.6 g/L、羽毛粉5.6 g/L、尿素4 g/L、磷酸二氫鉀0.4 g/L、硫酸鎂1.44 g/L、氯化鈣1.1g/L和氯化鈉5g/L。預(yù)測最高酶活為501.9U/mL。

為驗證模型預(yù)測的可靠性，在用預(yù)測得到的最佳培養(yǎng)基的條件下進(jìn)行3次發(fā)酵試驗，結(jié)果角蛋白酶酶活平均值為503.5 U/mL。預(yù)測值與實際值較吻合，說明該模型是比較合理的。

3 結(jié)論

本研究以試驗室篩選、保存的一株芽孢桿菌（Bacillus sp.）CJPE209為出發(fā)菌株，采用響應(yīng)面法對其發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，得到最終培養(yǎng)基：蔗糖13.6 g/L、羽毛粉5.6 g/L、尿素4 g/L、磷酸二氫鉀0.4 g/L、硫酸鎂1.44 g/L、氯化鈣1.1 g/L和氯化鈉5 g/L，此條件下角蛋白酶酶活為503.5 U/mL。通過驗證試驗確定其預(yù)測值和實際值較吻合，說明響應(yīng)面法優(yōu)化是合理的、可靠的。并且相較于響應(yīng)面優(yōu)化前的酶活417U/mL提高了20.74%。同時本研究對后期酶的規(guī)模生產(chǎn)提供參考和鋪墊。

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Q815

0254-5071（2017）05-0076-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.05.016

2017-02-23

國家自然科學(xué)基金項目（31401807）

蔣彪（1989-），男，碩士研究生，研究方向為發(fā)酵過程優(yōu)化與放大。

*通訊作者：蔡俊（1968-），男，教授，博士，研究方向為微生物發(fā)酵工程。