金屬離子對低糖酵母發酵活性的影響

程奔，李嘯，*，許超群，黃聰，李建華，鄭念，李勇

（1.三峽大學生物與制藥學院，湖北宜昌443003；2.安琪酵母股份有限公司，湖北宜昌443003；3.安琪酵母伊利有限公司，新疆伊利835000）

金屬離子對低糖酵母發酵活性的影響

程奔1，李嘯1，2*，許超群1，黃聰1，李建華2，鄭念3，李勇3

（1.三峽大學生物與制藥學院，湖北宜昌443003；2.安琪酵母股份有限公司，湖北宜昌443003；3.安琪酵母伊利有限公司，新疆伊利835000）

該研究考察了3種金屬離子對低糖酵母發酵活力的影響。首先，采用響應面設計法對酵母發酵培養基進行了優化。通過Plackett-Burman設計試驗篩選出3個主要因素：鎂離子（Mg2+）、鋅離子（Zn2+）、錳離子（Mn2+）。在這個基礎上應用最陡爬坡路徑法逼近最大響應值區域，然后利用響應面分析法確定最佳培養基配方為酵母抽提物（FM888）10 g/L、蛋白胨（FM318）20 g/L、葡萄糖20 g/L、六水合氯化鎂6.95 g/L、氯化鋅1.78 mg/L、一水合硫酸錳0.069 mg/L。其次，將優化培養基配方應用于低糖酵母發酵，干酵母活力可達426.86 mL/g。經過3次平行試驗的驗證，實際的平均發酵活力與預測的發酵活力值相近，比優化前提高了24.8%。此研究對低糖酵母的工業化生產具有一定的指導意義。

低糖酵母；發酵活力；金屬離子；最陡爬坡試驗；響應面法

CHENG Ben1,LI Xiao1,2*,XU Chaoqun2,HUANG Cong1,LI Jianhua1,ZHENG Nian3,LI Yong3
(1.College of Biological and Pharmaceutical,China Three Gorges University,Yichang 443003,China; 2.Angel Yeast Co.,Ltd.,Yichang 443003,China;3.Angel Yeast Yili Co.,Ltd.,Yili 835000,China)

酵母菌通常為圓形、橢圓形或臘腸形，可以發酵多種碳水化合物，屬于兼性厭氧微生物，在有氧和無氧狀態下都能生存和繁衍。酵母菌細胞含有4.5%～8.5%的核糖核酸[1]、約2%的B族維生素以及多種礦物質，此外，一些酵母菌還具有富集微量元素的作用[2]。酵母菌細胞壁含有多種可以增強機體免疫力的活性物質[3]。面包酵母是一種用來發面的具有發酵活性的酵母，根據用途的不同分為高糖酵母和低糖酵母。低糖酵母不能耐受高的滲透壓，在無糖條件下發酵力較高，因此適宜于含糖＜7%的面包發酵。一般用于生產咸面包、主食面包、無糖饅頭、咸糕點和蘇打餅干等。全球有很多國家以面包為日常主食，目前，全球消費人口超過18億，在中國其消費量也在逐年增加[4]。隨著人民生活水平的提升，低糖、低脂的烘焙食品的前景相當廣闊。因此對于提高低糖酵母發酵活性的研究非常有必要。

酵母等微生物在生長過程中需要依靠無機鹽來維持細胞的滲透壓，同時各種礦物質元素如鈣、鐵、鋅、錳等對酶及酶活等的作用有著重要影響[5-9]。華艷艷等[10]研究表明，在種子培養基中添加Mn2+能明顯提高紅發夫酵母的β-D-葡萄糖苷酶的活性并改變細胞的形態；在發酵培養基中添加0.1 g/L Mn2+，能明顯促進細胞生長及蝦青素合成；吳澤柱等[11]研究表明，對培養基營養鹽進行優化可以有效地提升酵母發酵力；卞芙蓉等[12]研究表明，在培養基中加入一定量的金屬離子對于提高谷胱甘肽產量具有良好的效果。

培養基優化方法眾多，其中以響應面法的效果最好[13]。響應曲面設計方法（response surface methodology，RSM）是通過對回歸方程的分析從而尋求最優工藝參數，來解決多變量問題的一種方法，同時也是優化條件、降低成本、提高效率、解決生產實際等問題的一種切實有效的統計方法[14-17]。本研究主要采用了Plackett-Burman試驗設計、最陡爬坡路徑法以及響應曲面設計方法探討了8種金屬離子對低糖酵母發酵活性的影響，并得到優化的培養基配方。此研究對低糖酵母的發酵生產具有一定的理論和實踐指導意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

低糖酵母（Saccharomyces cerevisiae）FX-2、酵母抽提物（FM888）、蛋白胨（FM318）：安琪酵母股份有限公司；其他試劑均為國產分析純。

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培養基：酵母抽提物10 g/L，蛋白胨20 g/L，葡萄糖20g/L。若配制YPD固體培養基，在YPD培養基中加入20g/L瓊脂粉。培養基在115℃條件下滅菌15 min。

1.2 儀器與設備

ZHWY-211D腳踏開門型大容量全溫度恒溫搖床：上海智城生物科技有限公司；TDL-60B型飛鴿牌系列離心機：上海安亭科學儀器廠制造；SPX-150生化培養箱：北京科偉永興儀器有限公司；雙向三速打面機：美國Hobart公司；SJA發酵力測定儀：瑞典SJA公司。

1.3 方法

1.3.1 甘油菌制備

從生產線上取低糖酵母種子，用一定量的蒸餾水稀釋成菌懸液，將菌懸液按照梯度進行稀釋（10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8），用100 μL移液槍從不同梯度稀釋液中取0.1 mL液體注入平板培養基（YPD固體培養基）上，用涂布棒涂抹均勻后將平板蓋好，倒置放于28℃恒溫箱中培養72h，每個稀釋梯度3個重復。選出具有典型酵母菌菌落特征的單菌落，在分離培養基（YPD瓊脂培養基）上劃線2～3次，進行純化。分離純化得到的單菌落接入裝有100mLYPD培養基的250mL搖瓶中，在溫度為28℃、搖床轉速為180r/min條件下培養20 h[18]。將培養好的菌液與滅菌后的甘油按照7∶3比例混合，搖勻后于-20℃條件下保藏。

1.3.2 發酵方法及培養條件[18]

將實驗室保藏的低糖酵母菌種用YPD斜面活化，恒溫培養箱中28℃培養2～3 d。將活化好的斜面接種到YPD液體培養基，在溫度為28℃、搖床轉速為180 r/min條件下培養30 h，獲得液體種子。試驗培養基中接入5%的液體種子，在溫度為28℃、搖床轉速為180 r/min條件下培養20 h。

1.3.3 無糖酵母發酵活力測定[19]

利用布氏漏斗進行發酵液抽濾，至無水為止，獲得鮮酵母；稱取4.0 g氯化鈉至250 mL三角瓶中，加入150 mL蒸餾水溶解，制成濃度為2.7%的鹽水溶液。稱取280.0 g中筋小麥粉，倒入和面機內，另稱取6.0 g鮮酵母于50 mL小燒杯中，加入少許上述鹽水溶解鮮酵母，將溶解后的鮮酵母倒入和面機面粉中，并用剩下的鹽水溶液將燒杯壁上殘余的鮮酵母洗滌干凈后全部倒入和面機中面粉上，計時，混合攪拌5 min，控制面團溫度為（30±0.2）℃，將面團放入SJA發酵儀的不銹鋼盒中，送入活力室內。發酵溫度為（30±0.2）℃，調節記錄儀零點，關閉放氣小孔，從和面開始后第7分鐘后開始計時，記錄第1、第2、第3小時面團產生的二氧化碳氣體量，以第2、第3小時面團產生的二氧化碳氣體量之和為該酵母的發酵力，結果用毫升數表示。在本研究中采用的是每克干酵母的活力值作為響應值，因此將實際檢測活力進行折算。折算方法為每克干物質含量對應活力值=實際檢測活力值/樣品干物質含量

1.3.4 響應面法優化培養基配方

根據Plackett-Burman試驗設計找出的顯著因素，進行最陡爬坡試驗，需要先逼近最佳區域后才能建立有效的響應面方程。最陡爬坡法實驗值變化的梯度方向為爬坡方向，根據各因素效應值的大小確定變化步長，能快速、經濟地逼近最佳值區域。

1.3.5 Plackett-Burman試驗設計

試驗選用N=12和因子數（N-1）為11的試驗設計，把每個因素設計成高（+1）和低（-1）2個水平，根據文獻查閱，確定了銅離子（A）、鈉離子（B）、鎂離子（D）、鉀離子（E）、亞鐵離子（G）、鈣離子（H）、鋅離子（J）、錳離子（K）這8個因素作為PB試驗的考察對象。

1.3.6 最陡爬坡試驗設計

根據Plackett-Burman試驗結果各顯著影響因素效應的大小設定步長及變化方向，以快速逼近最佳區域。而其他因素的取值則根據各因素效應的正負和大小確定，正效應的因素均取較高值，負效應的因素均取較低值。找到低糖酵母活力最高的處理，即為下一步響應面分析的中心點。

1.3.7 響應面分析試驗

根據最陡爬坡試驗結果，顯著因素以中心點為零水平，高水平和低水平分別比零水平高于或低于一個實際步長，用DesignExpert軟件設計中心組合試驗并進行響應面分析。

2 結果與分析

2.1 Plackett-Burman試驗設計結果

使用Minitab16軟件進行Plackett-Burman試驗，選擇了試驗次數N=12和因子數（N-1）為11的試驗設計，以C、F、I作為空項來估計試驗誤差，其中A、B、D、E、G、H、J、K則分別代表銅離子、鈉離子、鎂離子、鉀離子、亞鐵離子、鈣離子、鋅離子、錳離子，每個因素取高低兩個水平，以每克干物質含量對應的活力值作為響應值，Plackett-Burman試驗的因素與水平見表1。這些離子是分別以CuSO4·5H2O、NaCl、MgCl2·6H2O、KCl、FeCl2、CaCl2、ZnCl2、MnSO4·H2O的形式加入到培養基中。

表1Plackett-Burman試驗設計因素與水平Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman experiments design

表2為Plackett-Burman試驗設計及結果，對表2結果進行方差分析，結果見表3。由表3可知，各因素對結果的影響（En）就是該因素高（Rh）和低（Rl）結果之差的平均值，即En=（Rh-Rl）/6。t檢驗是用來比較真實變量和名義變量效應之間的顯著性，從而判斷該因素的相對重要性。由表3可以看到，各因素所代表的參數、水平及T值和P值。P值越小，則說明結果與對照的差異越顯著，對低糖酵母發酵活力具有顯著影響的因子依次是K＞J＞D，即錳離子＞鋅離子＞鎂離子，確定這三個因素作為下一步試驗的關鍵因素。

表2Plackett-Burman試驗設計與結果Table 2 Design and results of Plackett-Burman experiments

表3Plackett-Burman試驗結果分析Table 3 Analysis of Plackett-Burman experiments results

2.2 最陡爬坡試驗

對表3中各因素的P值進行比較可以發現，D、J、K3個因素P值最小，因此相對差異性最顯著。再根據最陡爬坡試驗結果可以估計系數的正負效應，結果見表4。由表4可知，隨著鋅離子濃度逐漸減小，錳離子、鎂離子濃度逐漸增大，低糖酵母發酵活力呈現先增大后減小的變化。當鎂離子質量濃度在900 mg/L，鋅離子質量濃度在0.8 mg/L，錳離子質量濃度在0.024 mg/L時，低糖酵母發酵活力達到最大，因此將第3組試驗的條件作為響應面試驗水平的中心點。

表4 最陡爬坡試驗結果Table 4 Results of the steepest ascent experiments

2.3 響應面分析法

以鎂離子900mg/L，鋅離子0.8mg/L，錳離子0.024mg/L為中心點，以每克酵母干物質對應的活力值作為響應值進行響應面分析，各自變量水平見表5，Box-Behnken試驗設計結果見表6，方差分析結果見表7。由表7可知，回歸模型的P值（Prob＞F）=0.005，這表明該模型是顯著的；而失擬值3.05＜4，則表明該模型失擬現象不顯著；根據表中的P值還可以看到，該模型的線性、平方的影響是顯著的，但交互作用影響不顯著。可知該模型的回歸系數R2=0.961 4，R2adj=0.891 8，表明模型擬合度很好。經回歸擬合后，得到二次多項式方程：

表5 響應面試驗設計因素與水平Table 5 Factors and levels of response surface experiments design

表6Box-Behnken試驗設計結果Table 6 Results of Box-Behnken experiments design

表7Box-Behnken設計方差分析Table 7 Variance analysis of Box-Behnken design

根據上述擬合回歸方程作出響應分析圖，結果見圖1。由圖1可知，響應面最高點表示活力的最大預測值，由鋅離子與鎂離子及錳離子的交互作用可以看出，鋅離子、鎂離子、錳離子趨近于某一濃度時，酵母發酵活力有最大預測值，即發酵活力的模型方程有最優解。說明該模型設計合理。

圖1 不同含量鋅離子、鎂離子、錳離子交互作用對酵母活力影響的響應曲面和等高線Fig.1 Response surface plots and contour line of effects of interaction between different concentrations of Mg2+, Zn2+and Mn2+on yeast activity

2.4 驗證性試驗

根據求得的最優回歸方程和試驗結果，得到最優的金屬離子組合：六水合氯化鎂質量濃度為6.949 g/L、氯化鋅質量濃度為1.780mg/L、一水合硫酸錳質量濃度為0.0687mg/L，酵母活力可達426.859 mL/g。為了驗證優化的可靠性，在該濃度下進行了重復搖瓶試驗，試驗重復3次，結果分別為424.5mL/g、420.66mL/g、428.3mL/g，平均值為424.487mL/g，與預測值426.859 mL/g接近，二者的良好擬合性證實了模型的有效性。優化后得到的低糖酵母發酵確定最佳培養基配方為酵母抽提物（FM888）10g/L，蛋白胨（FM318）20g/L，葡萄糖20 g/L，六水合氯化鎂6.949 g/L、氯化鋅1.78 mg/L、一水合硫酸錳0.068 7 mg/L。

3 結論

本研究通過Plackett-Burman試驗從眾多金屬離子中篩選出了3種對低糖酵母發酵活力有顯著影響的因子及濃度范圍，進一步通過最陡爬坡路徑試驗確定響應值區域，最后通過響應面設計、Design-Expert軟件分析，得到優化確定最佳培養基配方為酵母抽提物（FM888）10 g/L、蛋白胨（FM318）20 g/L、葡萄糖20 g/L、六水合氯化鎂6.949 g/L、氯化鋅1.780 mg/L、一水合硫酸錳0.068 7 mg/L。在搖瓶中進行驗證試驗，得到優化條件下酵母干物質活力平均值為424.487 mL/g，優化后每克干物質發酵活力提高了24.8%，對低糖酵母活力的提升具有明顯效果，對于低糖酵母的生產有一定的指導作用。

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Q93-335

0254-5071（2017）05-0053-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.05.011

2017-03-12

湖北省自然科學基金（ZRS2015000013）

程奔（1989-），男，碩士研究生，研究方向為微生物發酵過程控制。

*通訊作者：李嘯（1969-），男，副教授，博士，研究方向為微生物反應過程優化與控制。