美國紅楓組織培養研究進展

王婷婷

摘要根據國內外關于美國紅楓組織培養的研究，以及實際生產中的經驗系統闡述了美國紅楓組織培養體系建立的具體過程及研究進展，并提出了存在的問題及展望，為美國紅楓的大批量組培苗商業生產提供基礎資料。

關鍵詞美國紅楓；組織培養；組培苗

中圖分類號S723.1+32.6文獻標識碼A文章編號0517-6611（2017）11-0121-02

AbstractAccording to correlational research about tissue culture of Acer rubrum L. and experience in actual production，the specific process and research progress of tissue culture system were described systematically.It also put forward the existing problems and prospect to lay the foundation for the large quantities of A. rubrum L. seedlings commercial production.

Key wordsAcer rubrum L.；Tissue culture；Tissue culture seedling

美國紅楓（Acer rubrum L.）又名紅花槭，為槭樹科（Aceraceae）槭屬（Acer Linn.）一種重要的彩色觀葉類落葉喬木。美國紅楓的木材纖維非常短，做成的紙漿粗糙度適宜，是一種重要的造紙類木材[1]。美國紅楓生長速度快，每年達0.6～1.0 m，壽命可達100年[2]。自十幾年前引進我國以來，其以優良的性狀以及廣泛的適應性迅速在我國苗木市場占有一席之地。

美國紅楓傳統的繁殖方法主要有播種、扦插以及嫁接，但是相較于傳統的繁殖方法來說，組織培養可以在短期內獲得大批量的優質種苗，同時可以保持原有品種的優良性狀。國外對于美國紅楓組培體系建立的研究比較早，最早為1986年Welsh對于美國紅楓品種‘Red Sunset的研究。美國紅楓引入我國的時間不是很長，國內學者對其研究相對較晚，集中在2005年以后，主要是利用帶芽莖段作為外植體，通過腋芽萌發的方式建立組培體系，也有部分學者利用愈傷組織途徑進行擴繁。筆者通過概述美國紅楓組織培養各個階段關鍵技術的研究進展，以期為美國紅楓的大規模生產提供基礎資料。

1腋芽萌發方式

1.1外植體采集和消毒美國紅楓組培體系中最常用的外植體為帶芽莖段。帶芽莖段的類型以及取材時間對于消毒成功率影響很大。最容易消毒的外植體為當年的實生苗，但是考慮到當年實生苗萌芽時間長以及萌芽率較低，綜合各因素考慮，選擇半木質化莖段作為美國紅楓腋芽萌發的外植體最為合適[3]。另外，外植體消毒的難易程度也容易受到季節的影響，春季取材消毒效果最好[4]。

美國紅楓莖段外植體消毒通常先使用70%～75%乙醇浸潤20～30 s[5]。之后使用無菌水沖洗3～4次，使用次氯酸鈉或者0.1%升汞溶液進行后續消毒。當使用次氯酸鈉溶液作為消毒試劑時，采用2%次氯酸鈉5～10 min或者1%次氯酸鈉溶液4 min最為適宜；當使用0.1%升汞溶液作為消毒試劑時，最適宜的消毒時間為1～2 min，污染率為36.7%～433%。經過短時間的升汞溶液消毒新芽能夠正常生長，但長時間的消毒處理會導致腋芽不易抽芽，新芽畸形。筆者在實際生產中發現，相對于升汞而言，次氯酸鈉的消毒效果更加穩定，且對于后續的腋芽萌發影響較小。當使用紅楓的幼嫩莖段作為外植體時，利用2%次氯酸鈉溶液消毒15 min可以獲得最佳的消毒效果。

1.2外植體萌發

1.2.1外植體褐化。在對美國紅楓莖段進行萌芽培養時發現，外植體普遍容易褐化。外植體褐化程度通常與品種特性以及所用外植體老嫩程度有關，改良美國紅楓的褐化率要明顯低于美國紅楓，嫩枝的褐化率要低于硬枝莖段。

在培養基中添加防褐化物質以及在培養初期將外植體連續轉移至新鮮培養基會顯著減輕外植體的褐化情況。研究表明，用200 mg/L的VC與PVP處理外植體之后，褐化率明顯降低；在培養基中添加0.4%的活性炭，可降低褐化程度，但對抑制細菌污染沒有效果[6]；在培養基中分別加入1 g/L活性炭、10 mg/L硝酸銀、1 g/L PVP的處理，均對褐化有所抑制，但是如果在外植體培養初期每隔2 d轉移至新鮮培養基中，2～3次以后就可徹底去除褐化現象。

在實際生產中發現，在培養初期將外植體避光培養7 d左右，且調低培養室的溫度至20 ℃可以明顯降低褐化率。在培養基中添加0.5g/L的活性炭同樣有較好的改善效果，但是要注意的是由于活性炭對培養基中的激素有一定的吸附作用，在添加活性炭的同時要適當調高培養基中的激素濃度。

1.2.2萌芽培養基配方。美國紅楓外植體消毒成功之后需要在合適的萌芽培養基上進行腋芽的誘導培養。一般在進行美國紅楓外植體萌發時所用的基礎培養基為WPM、MS以及DKW，搭配使用細胞分裂素6-BA、TDZ、ZT和生長素IBA、NAA進行腋芽的誘導。

李源等[7]采用L16（45）正交試驗，結果顯示以WPM作為基礎培養基添加0.5 mg/L的IBA和2.0 mg/L的6-BA，萌芽率最高。羅煥榮[8]研究得到相似的結果。

宗樹斌[9]采用正交試驗得出，MS培養基最有利于腋芽的萌發，最佳的培養基組合為MS+6-BA 0.6 mg/L+IAA 0.4 mg/L。利用6-BA、TDZ和IBA誘導腋芽萌發，結果顯示單獨以6-BA作為細胞分裂素，無菌芽并不分化，MS+6-BA 0.5 mg/L+TDZ 0.1～0.2 mg/L+IBA 0.2 mg/L為最適的誘導培養基。也有一些研究使用DKW作為基礎培養基，所用的萌芽培養基配方為DKW+TDZ 0.01～0.03 mg/L+6-BA 0.015～0.025 mg/L+AC 0.4～0.8 g/L[10]。

在實際生產中發現，MS培養基優于WPM和DKW培養基。在WPM培養基中培養的組培苗瘦弱、生長勢緩慢，可能是與WPM 培養基中較低的離子濃度有關。在誘導培養基中添加0.01 mg/L的TDZ作為細胞分裂素，同時添加0.2～0.5 mg/L 6-BA可以明顯提高腋芽的萌動比率。

1.3增殖培養增殖培養也叫繼代培養，是組培苗擴大繁殖的重要步驟。培養基中激素的類型、濃度、比例是影響增殖效果的主要因素。

對于美國紅楓增殖培養基配方的研究主要集中在不同細胞分裂素和生長素的搭配使用上。TDZ作為一種新型的高效細胞分裂素，在木本類植物上應用廣泛，尤其在槭樹科植物組培應用上非常廣泛[11]。

在對美國紅楓增殖培養的研究中發現MS+6-BA 0.2 mg/L+TDZ 0.01 mg/L+IBA 0.2 mg/L為最適宜的增殖培養基，當TDZ濃度高于0.05 mg/L時，組培苗玻璃化率大于50%。研究表明，0.001 mg/L的TDZ和0.4 mg/L的NAA組合培養基更適于美國紅楓組培苗的增殖，將組培苗放在MS+TDZ 0.005 mg/L+NAA 0.5 mg/L的培養基中，30 d繼代1次，增殖倍率可以達3.8倍。

筆者在紅楓組培苗實際研發生產過程中同樣發現，TDZ作為細胞分裂素對于紅楓苗的組培增殖作用最為關鍵。單獨使用BA作為細胞分裂素時，很低的濃度就會造成愈傷組織大量生長以及植物玻璃化。而搭配使用低濃度的TDZ時，增殖出的小苗長勢旺盛，玻璃化概率大為降低。

1.4生根培養 美國紅楓組培苗生根相對簡單，在沒有添加生長素的培養基中都可以生根，但在添加有IBA和NAA的培養基中，生根率高于空白培養基。一般美國紅楓組培苗生根培養基中所添加的生長素為IBA，濃度為1～2 mg/L。在生根培養基中添加1～2 mg/L NAA，可以改善生根質量，提高組培苗的移栽成活率。美國紅楓生根所用的基礎培養基一般為MS、1/2MS以及WPM培養基，同時添加活性炭的生根培養基可以促進組培苗生根，添加的最適宜濃度為1 mg/L。

2愈傷組織途徑

愈傷組織誘導途徑屬于器官的間接發生方式，通過愈傷組織發生方式進行增殖可以得到更高的增殖倍率，同時變異系數高，容易選育出新的品種。在基因育種領域，愈傷組織對于遺傳轉化體系建立具有重要的作用。

2.1外植體的選擇 美國紅楓愈傷組織誘導所選用的外植體類型主要有嫩莖段、葉片以及種胚。嫩莖段在接入培養基中7 d左右出現粉紅色致密愈傷，同時愈傷組織生長較快、質量較好。葉片在接種后9～10 d出現嫩綠稍帶紅色的疏松愈傷。相比而言，莖段更適宜作為愈傷組織誘導的外植體。

2.2愈傷誘導及增殖培養基以美國紅楓莖段作為外植體時，愈傷組織非常容易進行誘導生長，而且美國紅楓的愈傷組織誘導一般需要使用較高濃度的細胞分裂素搭配使用生長素進行。王振龍等通過種胚誘導愈傷試驗發現，培養基中低濃度的無機鹽離子更有利于愈傷組織的誘導，因此選用1/2MS作為基礎培養基[12]。宗樹斌[9]利用正交試驗得出最適宜的愈傷組織誘導培養基為 WAP+6-BA 0.6 mg/L+IAA 0.3 mg/L。于傳[4]認為美國紅楓愈傷組織誘導最佳方案為選擇莖段作為外植體，并放在WPM+NAA 0.7 mg/L+KT 0.6 mg/L+BA 0.4 mg/L培養基上。同時應注意的是，美國紅楓愈傷組織的誘導需要光照，暗培養下的愈傷組織雖有少許可以增殖，但部分死亡。

初代培養中的愈傷組織一般需要在生長30 d后轉入增殖培養基中進行繼代培養，所用的增殖培養基和誘導培養基相似。但是愈傷組織在繼代3次后很容易發生褐化而死亡，這可能與美國紅楓的基因型有關。

2.3愈傷分化在植物組織培養愈傷再生途徑中，愈傷組織的分化是建立組培體系的重要步驟之一，只有愈傷組織可以分化為芽，組培苗才得以進一步擴繁。但是筆者在進行美國紅楓愈傷組織分化試驗中，大部分結果顯示愈傷組織量不斷增大，但均未能分化誘導出芽。

如上所述，美國紅楓經過愈傷組織分化階段進行間接再生時，技術難度較高，主要困難在于愈傷組織分化成芽的能力較弱，需要進一步研究。

3存在問題和展望

美國紅楓莖段汁液豐富，在組織培養過程中極易褐化，如需大量的工廠化生產，仍需探索更好的防止褐化的標準化流程。同時，隨著繼代次數的增加，美國紅楓組培苗很容易出現玻璃化以及品種退化的現象，在大規模生產中，需要通過長期多代的試驗來確定穩定的培養基配方。通過愈傷組織再生途徑很容易產生品種變異，是一種很好的新品種選育方式，目前的技術并不能使愈傷組織有效地分化為不定芽。因此，應加大此方面的科研力度。

目前市場上存在的美國紅楓變種有很多，而大多數研究僅是針對美國紅楓的原始種。不同變種的美國紅楓組織培養流程差異較大，在對美國紅楓組織培養進行后續研究時，需要針對不同的品種進行研究。同時，為了滿足工廠化生產要求，需要對組培技術的各個方面進行改進，以期將生產成本控制到最低。開展美國紅楓愈傷組織誘變工作，培育具有優良性狀的新品種，將美國紅楓組織培養技術應用到工廠化生產中具有廣闊的前景。

參考文獻

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