引種成都后歐李生長期多酚含量的變化

摘要 [目的]探究歐李引種成都后其生長期多酚含量的變化，為歐李多酚類物質的研究提供參考。 [方法]采用酒石酸鐵比色法測定歐李引種成都后的多酚含量。 [結果]用95%甲醇提取歐李多酚效果最好，歐李體內的多酚含量并不會在植物體內大量積累，多酚含量在12∶00左右溫度較高和傍晚時出現較大值，在14∶00溫度最高時較低，在19 ℃左右時也較低，當有蟲害脅迫時歐李體內多酚含量增加。 [結論]多酚對于植物的次生代謝有重要影響，在鮮葉中的含量可以反映植物次生代謝的強度，并反映植物對環境的適應性以及對各種環境脅迫的抵抗力。

關鍵詞歐李；多酚；酒石酸鐵比色法；次級代謝

中圖分類號S662.5文獻標識碼A文章編號0517-6611（2017）11-0011-04

Abstract[Objective] To explore changes of polyphenol content of Prunus humilis Bunge introduced in Chengdu during growing period and provide theoretical basis for researching polyphenol content of Prunus humilis Bunge. [Method] We determined the polyphenol content of Prunus humilis Bunge introduced in Chengdu during growing period by tartaric acid iron assay. [Result] The polyphenol of Prunus humilis Bunge extracted by using 95% methanol was the best， and the content of polyphenol of Prunus humilis Bunge would not accumulate internally in plants. The content of polyphenol reached higher in around 12∶00 and when the temperature was higher in the evening， it would be the minimum at 14∶00 when the temperature was the lowest， and the content was also very low in about 19 ℃；the content of polyphenol would increase under herbivore stress. [Conclusion] Polyphenol has important effect on metabolism of plant. The content of its fresh leaves of plants can reflect the intensity of secondary metabolism， the reaction of plant adaptation to the environment， and resistance to various environmental stresses.

Key wordsPrunus humilis Bunge；Polyphenol；Tartaric acid iron assay；Secondary metabolism

多酚是泛指一類性質不同的多羥基酚（以鄰位和連位為主），包括兒茶素類、黃酮及黃酮類化合物、花色素類、酚酸、縮酚酸類多酚化合物的復合體。多酚具有C6-C3-C6結構，廣泛存在于各種植物體內[1-2]。多酚中的C3部分具有高度的還原特性，所以具有很強的抗氧化能力，多酚具有抗氧化、清除自由基、降血壓、降血脂、預防心血管病、抗突變、抗輻射、抑菌、抗癌等功能，并且毒副作用小[3-7]。因此，多酚應用前景非常廣闊，能用于食品、醫藥、日化等領域。

歐李引種到成都后[8]，各種性狀特性可能發生變化。次級代謝產物區別于初生代謝產物有很大不同，初生代謝產物是通過代謝活動所產生的自身生長和繁殖所必需的物質，如多糖、脂類、氨基酸、核苷酸、維生素等[9]。生物通過初級代謝，能使各種營養物轉化為自身的結構物質、具有生理活性物質或者為生長提供所需能量，所以初生代謝產物通常都是機體生存必不可少的物質，這些物質的合成過程中某個環節發生障礙，輕則可能引起生物生長停止，重則可能導致機體發生突變或者死亡，是一種基本代謝類型。而植物次生代謝產物是植物對環境的一種適應產物，在進化過程中植物與生物和非生物因素長期相互作用的結果。植物次生代謝產物在對環境脅迫的適應、植物間相互競爭、植物抵抗病蟲危害中起到重要作用[10]。多酚作為植物重要的次級代謝產物，歐李引種成都后，環境的改變可能會改變歐李的生理過程，能反映歐李對于環境的適應性，對于歐李引種研究有重要意義。同時多酚物質本身具有很大的開發價值，通過研究歐李體內多酚的含量，研究其是否具有潛在開發提取價值也有重要意義。筆者研究了歐李引種成都后，其生長期多酚含量的變化，以期為歐李引種研究和多酚的開發利用提供參考。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1植物材料。供試植物材料為2008年秋季山西引種到成都的歐李，試驗前1年的3月移栽至花盆中，正常管理。

1.1.2主要試劑與儀器。磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、硫酸亞鐵、酒石酸鈉鉀、甲醇、乙醇、丙酮、焦性沒食子酸等均由四川成都科龍化工試劑廠提供，均為分析純。電子天平為上海越平科學儀器有限公司產品；7200可見光分光光度計為尤尼柯（上海）儀器有限公司產品；數顯恒溫水浴鍋為常州澳華儀器有限公司產品。

1.2方法

1.2.1試劑的配制。

1.2.1.1磷酸緩沖液的配制。 用電子天平稱取71.628 g磷酸氫二鈉溶于500 mL燒杯中，用玻璃杯攪拌溶解，然后倒入1 L容量瓶中定容，配制成0.2 mol/L磷酸氫二鈉母液，再用電子天平稱量31.202 g磷酸二氫鈉溶于500 mL燒杯中，用玻璃杯攪拌溶解，倒入1 L容量瓶中定容，配制成0.2 mol/L磷酸二氫鈉母液。分別配制pH 6.8和7.5的緩沖液。pH 68的緩沖液每100 mL加入0.2 mol/L磷酸氫二鈉母液49 mL和0.2 mol/磷酸二氫鈉母液51 mL。pH 7.5的緩沖液每100 mL加入0.2 mol/L磷酸氫二鈉母液84 mL和0.2 mol/L磷酸二氫鈉母液16 mL[11]。上述溶液均存儲于棕色瓶中。

1.2.1.2酒石酸鐵溶液的配制。用電子天平稱量1 g硫酸亞鐵和5 g酒石酸鈉鉀分別溶解于蒸餾水中，混合后定容至1 L，并儲存于棕色瓶中，可穩定10 d[12-13]。

1.2.2提取液的選擇。取歐李植株新鮮葉片，在電子天平上準確稱重，用自來水沖洗，再用蒸餾水沖洗干凈，用不銹鋼剪刀快速剪成碎片，置于帶塞三角瓶中，分別加入95%甲醇、95%乙醇、無水丙酮試劑5 mL，于微沸水中浸提30 min，冷卻至室溫，取1 mL樣品上清液，加入1 mL蒸餾水、2 mL酒石酸鐵溶液和6 mL磷酸緩沖液，混合，以試劑作為空白對照，于540 nm波長處測定光密度。

1.2.3緩沖液的選擇。不同pH對多酚含量的測定有一定的影響，根據文獻報道[3-6，12-15]，有選擇pH 6.8的磷酸緩沖液，也有選擇pH 7.5的磷酸緩沖液。為了確定哪一種緩沖液更合適，加樣方法如“1.2.2”，提取試劑為甲醇，分別對pH 6.8和pH 7.5的磷酸緩沖液測定光密度。

1.2.4歐李樣品多酚含量的測定。采用酒石酸鐵法[12]。取新鮮歐李葉片，用電子天平稱重，用自來水沖洗，再用蒸餾水沖洗干凈，吸去表面水分后用不銹鋼剪刀剪成碎片，置于帶塞三角瓶中，加入5 mL 95%甲醇，置于恒溫水浴鍋中在68 ℃微沸狀態中提取33 min，冷卻至室溫。用移液槍吸取上清液1 mL加入試管中，再分別加入1 mL蒸餾水、2 mL酒石酸鐵和6 mL pH 7.5的磷酸緩沖液，在分光光度計上測定光密度。

1.2.5線性關系的考察。標準品用焦性沒食子酸代替多酚標準品，測得多酚含量以沒食子酸計。稱量焦性沒食子酸1 g溶于50 mL蒸餾水中，配制成母液，依次取5、10、15、20、25、30 μL分別加入試管中，向試管中分別加入1 995、1 990、1 885、1 880、1 875、1 870 μL蒸餾水，再依次加入2 mL酒石酸鐵和6 mL pH 7.5的磷酸緩沖液，然后立即在7200型可見光分光光度計上測定光密度。

2結果與分析

2.1標準曲線的繪制以焦性沒食子酸為多酚標準品，求得多酚標準曲線方程為y=1.508 9x+0.023 7，回歸系數為R2=0.996 7，線性關系良好（圖1）。

2.2提取液的選擇取歐李植株中部的新鮮完整葉片，分別用95%甲醇、95%乙醇和無水丙酮提取歐李葉片中的多酚，用焦性沒食子酸繪制標準曲線為y=1.508 9x+0.023 7，將測得的光密度帶入標準曲線求得多酚含量。因為樣品提取液為5 mL，而測定時取樣體積為1 mL，所以樣品中的總多酚含量為X=5（Y-0.023 7）/1.508 9，多酚含量占歐李取葉重的百分比為η=X/Z。式中， X為樣品多酚含量；Y為吸光度；Z為取樣總重。

結果表明，用95%甲醇提取歐李葉片中的多酚效果最好，多酚含量為0.802 5%，明顯高于95%乙醇和無水丙酮提取（表1）。因此，選擇95%甲醇作為提取液。

2.3緩沖液的選擇分別取A、B、C、D 4株歐李植株中部的新鮮完整葉片，緩沖液選擇方法同“1.2.2”，用求得的總多酚除以4株植株的總質量Z，求歐李葉片多酚含量百分比。

由表2可知，pH 7.5的磷酸緩沖液對歐李多酚含量的測定效果更好，顯色反應更加明顯，所以選擇pH 7.5的磷酸緩沖液作為歐李葉片多酚提取的緩沖液。

2.4歐李葉片樣品多酚含量

2.4.1歐李葉片總多酚含量（以沒食子酸計）的測定。 歐李葉片多酚的提取和測定方法同“1.2.2”和“1.2.4”。歐李總多酚在歐李葉片中的百分比為η1=X1/Z1，其中X1為測得的多酚含量總和；Z1為取樣葉片總重。由該公式求得歐李植株中新鮮葉片多酚含量（以沒食子酸計）為0.770 16%。

2.4.24株歐李植株中多酚含量的測定。分別將A、B、C、D 4株歐李新鮮葉片的多酚含量相加，除以從A、B、C、D 4株歐李所取葉片總重，測多酚在A、B、C、D 4株植株中的百分比。計算公式為：η=（X/Z）×100%。式中，η為多酚含量百分比；X為多酚總重；Z分別為A、B、C、D 4株植株葉片的重量和。經計算，A、B、C、D 4株歐李植株中多酚含量（以沒食子酸計）分別為0.794 61%、0.768 75%、0.805 65%和0655 41%。可見，各植株的多酚含量各不相同，但相差不大。

45卷11期王智君引種成都后歐李生長期多酚含量的變化2.4.3歐李多酚含量的日變化。以A、B、C、D 4株歐李植株多酚含量總重占鮮葉的百分比（測定方法同“1.2.2”和“1.2.4”）隨時間變化，觀察1 d內歐李植物體內多酚含量的變化情況。

由圖2可知，歐李葉片中的多酚含量會在一天（白晝）之中隨著時間的變化而發生變化。多酚含量從上午開始隨著時間的變化而開始增加，到12∶00左右達到較大值，然后隨著時間的推移而逐漸呈下降趨勢，14∶00左右達到最小值，隨后又逐漸增加。

2.4.4歐李生長期葉片多酚含量的變化。取歐李植株中部的新鮮完整葉片，每天每次試驗共有A、B、C、D 4個平行植株，每天第1次取材在09∶30左右，取每天第1次取材時A、B、C、D 4株歐李植株多酚的平均含量（方法同“1.2.2”和“1.2.4”）。觀察多酚在歐李生長期體內的變化情況。

由圖3可知，多酚作為次級代謝產物，并不會隨著歐李生長期的進行在體內積累，但其含量會發生變化，歐李新鮮葉片中的多酚含量在0.77%左右。

2.4.5氣溫對歐李多酚含量的影響。統計得出每次取樣時A、B、C、D 4株歐李的平均多酚含量隨氣溫的變化情況（方法同“1.2.2”和“1.2.4”），相同溫度求所有植株平均值（以溫度升序排列）。

由圖4可知，多酚含量會隨著氣溫的變化而發生變化。在低溫或者高溫狀態下歐李植物體內多酚含量低，在19 ℃左右時多酚含量也很低，而在13和24 ℃左右多酚含量較高。

3結論與討論

3.1提取液的確定用酒石酸鐵比色法提取多酚時，磷酸緩沖液的選擇有不同配比，大部分研究選擇pH 7.5的磷酸緩沖液，也有選擇pH 6.8的磷酸緩沖液。該研究發現，用pH 7.5的緩沖液對歐李葉片多酚測定效果較好。選擇提取試劑時，有選擇50%丙酮的，也有選擇80%乙醇溶液的，還有選擇60%乙醇溶液的，但大多數多酚研究都是對茶葉多酚的研究。該研究發現，用95%甲醇提取歐李葉片多酚效果更好。因此，采用酒石酸鐵比色法測定歐李中多酚含量，用95%甲醇提取，并用pH 7.5的磷酸緩沖液效果最好。

3.2多酚測定過程中的注意事項在試驗過程中偶然發現4月16日和4月21日2個異常點。在測光密度時發現測出的光密度很大，求得的多酚含量很高，明顯大于平均值0.770 16%（圖5）。觀察樣品液發現，產生了大量淡綠色絮狀沉淀。

4月16日產生大量的淡綠色絮狀沉淀，后經過試驗驗證分析，產生的絮狀沉淀為高溫狀態下生成。驗證方法是加入1 mL甲醇、2 mL酒石酸鐵和6 mL磷酸緩沖液，置于高溫狀態下觀察發現產生極少量白色絮狀物，為了確定沉淀是由甲醇還是提取液產生的，將歐李葉片多酚提取液由甲醇換為丙酮提取，將丙酮樣品提取液取樣1 mL，加入2 mL酒石酸鐵，6 mL磷酸緩沖液，置于高溫狀態下馬上產生大量淡綠色絮狀沉淀，所以確定引起大量沉淀物質應該為從歐李葉片提取液中的1種物質。4月21日發現光密度增加明顯，逐漸產生淡綠色絮狀沉淀。后經過試驗發現，是由于長時間放置產生的。因此，在提取后測光密度時要特別注意對提取液降溫至常溫，然后加入酒石酸鐵和磷酸緩沖液后馬上測光密度，否則將會產生淡綠色絮狀沉淀，使光密度增加，導致測得多酚含量增加。但是對于引起產生淡綠色絮狀沉淀的物質尚不明確，有待進一步研究。

3.3關于多酚次生代謝的環境因素初生代謝與次生代謝一樣是植物體內重要的生理代謝，而次生代謝物質在協調與環境的關系中有重要作用。對多數植物而言，次生代謝產物的合成與積累往往根據環境的變化而發生變化。根據環境變化來決定合成次生代謝產物的種類和數量，在特定的環境下合成特定的次生代謝產物，或者顯著增加特定的次生代謝產物。而幾種環境因子可能影響1種次生代謝產物，1種環境因子也可影響幾種次生代謝產物的合成和積累，相同環境因子對不同植物的同一次生代謝產物影響效果也不一定相同[16-17]。目前，人們環境條件對植株體內次生代謝產物形成和積累誘導作用的生理機制存在不同的認識，提出了不同的誘導機制假說來解釋不同環境條件下植物次生代謝的變化，主要的誘導機制假說有碳素/營養平衡（CNB）假說、生長/分化平衡（GDB）假說、最佳防御（OD）假說和資源獲得（RA）假說等。這些假說揭示或解釋了不同環境條件下植株體內合成和積累規律，但都認為環境脅迫時，次生代謝產物數量增加[16-17]。蘇文華等[10]研究認為在環境脅迫的條件下，植株生長下降，次生代謝產物數量增加，而在良好環境條件下，植株生長快，次生代謝產物數量少，但當環境嚴重脅迫時，植株生長和次生代謝又都受阻礙。光照、溫度、水分、礦物質、CO2、蟲害等環境因素是影響次級代謝產物的主要原因。黃璐琦等[9]研究認為植物在受蟲害損傷后，在次生代謝方面最明顯的變化是酚類化合物含量的增加，在遮陰條件下，光合作用降低，體內C/N比降低，酚類、萜烯類物質減少。

該研究發現，歐李引種到成都后，歐李植物體內的多酚含量并不會發生明顯變化，但可能會隨季節發生變化。研究發現歐李葉片中的多酚會在一天（白晝）之中隨著時間的變化而發生變化，從上午開始隨著時間的變化而開始增加，到12∶00左右達到較大值，然后隨時間的推移而呈下降趨勢，14∶00左右達到最小值，隨后又開始增加。通過氣溫對歐李體內多酚的影響的研究發現，歐李體內多酚隨溫度也會發生變化，通過綜合溫度和日變化情況發現，歐李葉片中的多酚含量變化可能和溫度有很大關系。分析溫度和日變化情況，歐李的次級代謝產物多酚可能在高溫和低溫情況下都很低，在19 ℃左右時較低，而在13 ℃和較高溫度時多酚含量較高，這與黃璐琦等[9]的研究結果相符合，植物在良好環境條件（19 ℃左右）下體內次生代謝產物多酚含量少，在環境脅迫下（13 ℃和較高溫度）植物體內多酚含量較多，環境嚴重脅迫時（清晨和14∶00左右地表溫度很高）次生代謝產物多酚含量很低。歐李植株通過體內次生代謝產物的變化以加強對環境變化的適應，所以提取多酚的最佳時間應該在12∶00左右和傍晚環境脅迫時，此時多酚在歐李體內積累較多。另外，在觀察4株歐李形態后發現，C植株有蟲害情況，且其多酚含量也較高，這恰好與蟲害脅迫次級代謝產物增加相符合。

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