全基因組范圍葡萄熱休克轉錄因子的鑒定與分析

王鵬飛 蘇玲 蔣錫龍 楊立英 宮磊 任鳳山 王詠梅

摘要[目的]從全基因組范圍鑒定葡萄熱休克轉錄因子基因家族，并對其基因結構、蛋白結構、基因啟動子、基因在進化中受到的選擇壓力以及其編碼基因在非生物脅迫下的表達變化進行綜合分析，并對葡萄熱休克轉錄因子基因家族的密碼子使用偏好性進行研究，分析影響葡萄熱休克轉錄因子基因家族密碼子使用偏好性的因素。[方法]利用葡萄基因組數據庫相關數據建庫結合本地BLAST法鑒定序列，利用多重序列比對，進化樹構建等生物信息學方法進行分析。[結果]鑒定了20個葡萄熱休克轉錄因子，并將其分為4個亞組。其中9個熱休克轉錄因子基因在冷脅迫1 h下表達上調，2個在冷脅迫4 h下表達上調。在高溫脅迫14 d條件下，7個熱休克轉錄因子基因表達量下調。在高溫脅迫42 d條件下，8個熱休克轉錄因子基因表達量下調。此外發現，葡萄熱休克轉錄因子家族各成員基因存在密碼子使用偏好性。[結論]該研究為深入研究葡萄熱休克轉錄因子的功能提供了有用的信息。

關鍵詞熱休克轉錄因子；葡萄；非生物脅迫；選擇壓力；密碼子偏好性

中圖分類號S188文獻標識碼A文章編號0517-6611（2017）32-0144-08

Genomewide Identification and Analysis of the Heat Shock Transcription Factor Family Genes in Grape

WANG Pengfei，SU Ling，JIANG Xilong，REN Fengshan*，WANG Yongmei* et al

（Shandong Grape Research Institute，Jinan，Shandong 250100）

Abstract[Objective]To identify and analyze the Hsfs from grape genome， and study the expression of Hsf genes in grape in various stress conditions， gene structure of grape Hsf， cisregulation elements of grape Hsf promoters， conserved motif of grape Hsf protein， structure of grape Hsf protein， selection pressure which the grape Hsf genes underwent in evolution history and so on. Additonally， to study the codon bias of grape Hsf gene family.[Method]The amino acid sequences of Hsfs were extracted from grape genome database using BLAST programs. Protein multiple sequence alignment and neighborJoining （NJ） trees were constructed.[Result] We identified 20 grape Hsfs. According to phylogenetic relationship， these Hsfs were divided into A， B， C and D subfamilies. The expression of 9 Hsfs were upregulated under cold stress in 1 hour and 2 were upregulated under cold stress in 4 hours. The expression of 7 Hsfs were downregulated under heat stress in 14 days and 8 were downregulated under heat stress in 42 days. Additionally， there had codon bias in grape Hsf family members.[Conclusion]The study provided useful information for further understanding the function of Hsfs in grape.

Key wordsHeat shock transcription factors；Grape；Abiotic stress；Selection pressure；Codon bias

非生物脅迫包括熱脅迫、冷脅迫以及鹽脅迫等。這些非生物脅迫影響植物正常的生長發育并會導致嚴重的作物減產[1-3]。植物作為固著生物，不能依靠移動來逃避非生物脅迫壓力[4]。然而，植物為了適應環境，已經進化出了一系列應對這些非生物脅迫的策略[4-5]。在植物適應非生物脅迫策略中以及植物對環境壓力的耐受過程中，轉錄因子起到了關鍵的作用。轉錄因子調控成百上千的基因表達，使得植物可以耐受逆境[6-9]。

植物熱休克轉錄因子（heat shock transcription factors，Hsf）是一種重要的轉錄因子，這類轉錄因子可以使植物在熱、冷、干、鹽脅迫中所受的傷害減小[2，4，10-14]。 熱休克轉錄因子還可以通過激活相關的基因來保護細胞免遭極端毒性的傷害[15-18]。研究顯示，熱休克轉錄因子還涉及植物生長和發育[19-21]。

與其他轉錄因子類似，熱休克轉錄因子具有N端的DNA綁定結構域（Nterminal DNA binding domain，DBD）。而熱休克轉錄因子的DNA綁定結構域與一段寡聚化功能結構域（oligomerization domain，OD）相鄰。寡聚化功能結構域是由兩段疏水性的七肽重復序列（hydrophobic heptad repeats，HRA/B）組成。這兩段疏水性的七肽重復序列可以形成一個亮氨酸拉鏈型蛋白質相互作用螺旋線圈結構域（leucine zippertype protein interaction coiledcoil domain）[22-25]。有的植物熱休克轉錄因子含有核定位信號結構域（nuclear location signal，NLS），核輸出信號結構域（nuclear export signal，NES）或C端激活結構域（Cterminal activation AHA）[4，26-29]。

目前的研究顯示，基于疏水性的七肽重復序列的結構以及進化樹分析，植物熱休克轉錄因子一般被劃分為A、B和C共3個亞家族[2，9，11，17]。

葡萄（Vitis vinifera L.）是一種重要的果樹，隨著葡萄基因組序列的公布以及最新拼接注釋版本的公布，全基因范圍鑒定葡萄熱休克轉錄因子基因以及對其深入分析已成為可能。該研究從全基因組范圍鑒定葡萄熱休克轉錄因子基因家族，并對其基因結構、蛋白結構、啟動子、進化中受到的選擇壓力進行綜合分析；同時對葡萄熱休克轉錄因子基因家族密碼子使用偏好性進行研究，分析影響葡萄熱休克轉錄因子基因家族密碼子使用偏好性的因素。

1材料與方法

1.1序列篩選

葡萄基因組數據以及相關的蛋白，CDs數據從最新版本葡萄基因組數據庫（http：//www.genoscope.cns.fr/externe/GenomeBrowser/Vitis/）中獲得，數據庫版本為V2.0。熱休克轉錄因子的最保守結構域為Hsftype DBD結構域，該結構域的HMM ID為PF00447。從Pfam數據庫（http：//pfam.xfam.org/）中獲得該結構域的最保守模型序列，用該序列進行本地BLAST（E<0.001），從而搜索葡萄中全部的熱休克轉錄因子。利用在線軟件SMART（http：//smart.emblheidelberg.de/）確定這些搜索到的葡萄熱休克轉錄因子是否具有完整的Hsftype DBD結構域，并檢測其他的功能結構域，如HRA/B。沒有完整Hsftype DBD結構域的序列被過濾，不被用于研究。

1.2多重序列比對與進化樹分析

利用在線軟件Clustal Omega（http：//www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo）進行蛋白多重序列比對分析。利用MEGA 6.0軟件構建鄰接進化樹（NeighborJoining tree）。進化樹包括該研究搜索到的20個葡萄熱休克轉錄因子和前人研究的21個擬南芥熱休克轉錄因子，全部熱休克轉錄因子的基因ID見表1。

1.3保守基序（motif）分析

利用在線軟件Multiple Em for Motif Elicitation（MEME）suite 4.11.1（http：//meme.nbcr.net/meme/）鑒定葡萄熱休克轉錄因子蛋白中保守的基序（motif）（參數設置為output motifs：20；minimum motif width：6；maximum motif width：300）。

1.4基因結構可視化作圖

采用在線軟件Gene Structure Display Server 2.0（http：//gsds.cbi.pku.edu.cn/）對葡萄熱休克轉錄因子的基因結構進行可視化作圖，并分析內含子的相位。

1.5選擇壓力分析

利用Codeml program under PAML（phylogenetic analysis maximum likelihood）version 4.7 software軟件[30]分析葡萄熱休克轉錄因子基因家族在進化過程中遭受何種選擇壓力。該軟件分析包括6個位點模型分析：M0（one ratio）、M1a（neutral）、M2a（positive selection）、M3（discrete），M7（beta）以及M8（beta and ω）模型。其中M0與M3，M1a與M2a 以及M7與M8 模型之間的兩兩比較可以用于發掘正向選擇位點[31]。

1.6基因表達分析

葡萄熱休克轉錄因子基因在葡萄各個組織中，高溫脅迫誘導和冷脅迫誘導等表達的芯片表達譜數據從Plant Expression Database（http：//www.plexdb.org/）數據庫以及GEO數據庫（www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/）中進行收集。MAS5calculated Signal intensity Value作為標準化的表達量用于差異基因分析和可視化熱圖繪制，熱圖用Mev4.0軟件進行繪制。

1.7啟動子分析

收集葡萄熱休克轉錄因子基因起始密碼子上游1 500 bp作為啟動子序列用于下一步分析。利用在線軟件PLANTCARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）進行啟動子分析，鑒定葡萄熱休克轉錄因子基因啟動子中的順式調控元件。

1.8密碼子偏好性分析

1.8.1密碼子使用偏好性參數的計算。

利用CodonW1.4軟件計算同義密碼子相對使用頻率（relativesynonymous codonusage，RSCU）、有效密碼子數（effective number of codon，ENC）、最優密碼子使用頻率（frequencyof optimal codons，Fop），GC3s（GC3s為密碼子第三位GC含量），密碼子偏愛指數（codon bias index，CBI），密碼子適應指數（codon adaptation index，CAI）等參數。

1.8.2相關性分析。

為了研究密碼子使用偏好性所受到的影響因素，該研究還分析了Fop、CBI、CAI與外顯子數目、外顯子GC含量、外顯子GC3s的相關性。

2結果與分析

2.1葡萄Hsf家族的鑒定與進化樹分析

根據葡萄基因組中的全蛋白數據建庫，利用Hsftype DBD domains（Pfam：PF00447）保守模型序列進行本地BLAST，并利用SMART篩除軟件假陽性序列，共鑒定出20個葡萄熱休克轉錄因子（表1）。序列長度最小的葡萄熱休克轉錄因子基因ID為VIT_205s0029g00340，長度為96個氨基酸；序列長度最大的葡萄熱休克轉錄因子基因ID為VIT_211s0016g02010，長度為663個氨基酸。

利用這20個葡萄熱休克轉錄因子和21個擬南芥熱休克轉錄因子的全長蛋白序列構建進化樹。按照進化樹顯示的進化關系以及之前對擬南芥熱休克轉錄因子的分組研究[4]，發現擬南芥熱休克轉錄因子家族可以被劃分為A、B、C 3組，而葡萄熱休克轉錄因子家族可以被劃分為A、B、C和D共4個大組。其中，A大組又可以被劃分為A1、A2、A3、A4、A6、A7、A8和A9共9個亞組；而B大組又可以被劃分為B1、B2、B3和B4共4個亞組（圖1）。以往研究表明，植物熱休克轉錄因子家族基于疏水性的七肽重復序列結構，以及進化樹分析一般可以被分為A、B和C共3個亞家族[2，9，11，17]。而該研究進化樹結果顯示，葡萄熱休克轉錄因子中存在一個不同的亞家族，將其命名為D組，包括2個成員：VIT_205s0029g00350和VIT_208s0007g03900。

蛋白序列的多重比對分析顯示，D組這2個成員疏水性的七肽重復序列的結果也與A、B、C組成員略有不同（圖2），這從一定程度上支持了進化樹的結論。與擬南芥相同，葡萄熱休克轉錄因子的C組成員也只包含1個成員VIT_211s0016g03940。而葡萄熱休克轉錄因子家族中不存在A3、A5、A7和A9亞組的成員。

安徽農業科學2017年

2.2葡萄Hsf家族的特征

大部分的葡萄熱休克轉錄因子基因含有1個內含子和2個外顯子，而VIT_208s0007g03900沒有內含子。VIT_211s0016g02010含有12個外顯子和11個內含子。大部分葡萄熱休克轉錄因子基因的內含子的相位是相位0，除了VIT_204s0008g01110含有1個相位1的內含子，VIT_204s0008g01110含有1個相位1的內含子，VIT_211s0016g02010含有3個相位1的內含子和3個相位2的內含子（圖3）。整個葡萄熱休克轉錄因子基因家族的49個外顯子中只有2個對稱外顯子。過多的對稱外顯子會造成外顯子的復制和重排[32-33]。通過分析葡萄熱休克轉錄因子基因家族的基因結構，發現葡萄熱休克轉錄因子基因結構相對比較穩定。

而蛋白二級結構分析顯示，相對于疏水性的七肽重復序列，葡萄熱休克轉錄因子家族的DNA綁定結構域相對保守（圖4）。

采用The Multiple EM for Motif Elicitation（MEME）基序研究工具分析蛋白二級結構分析。在葡萄熱休克轉錄因子家族中，發現了20個保守的基序（motif），大部分家族成員包含motif1和motif3。然而，D組的2個家族成員都不含有motif1和motif3。大部分B組成員含有特殊的motif4，而部分A組成員含有特殊的motif6，部分A組成員含有特殊的motif20（圖5）。表2為葡萄熱休克轉錄因子最保守的motif基序序列。

2.3葡萄Hsf家族的選擇壓力分析

利用Codeml program under PAML軟件中的位點模型分析不同葡萄熱休克轉錄因子亞家族在進化中所遭受的選擇壓力，探索是否不同亞家族遭遇不同的選擇壓力。選擇壓力（selective pressure），又稱為進化壓力，指外界施與一個生物進化過程的壓力，從而改變該過程的前進方向。當該亞家族的Ka/Ks（ω）>1，說明該亞家族受到正向選擇（positive selection）；當該亞家族的Ka/Ks（ω）=1，說明該亞家族受到中性選擇（neutral selection），當該亞家族的Ka/Ks（ω）<1，說明該亞家族受到純化選擇（purifying selection）。由于葡萄熱休克轉錄因子的C組只包含1個基因，所有只分析A、B和D組在葡萄進化中所受到的選擇壓力。

結果顯示，葡萄A組熱休克轉錄因子在進化過程中遭遇了純化選擇（ω=0.69 069）。M1a與M2a比較分析發現了41個正向選擇位點，其中包括1個顯著（P<0.01）的正向選擇位點 409 G[Bayes Empirical Bayes（BEB）analysis]。M7與M8比較分析發現了120個正向選擇位點，其中包括2個顯著（P<0.01）的正向選擇位點400 - 和409 G[Bayes Empirical Bayes（BEB）analysis]。葡萄B組熱休克轉錄因子在進化過程中遭遇了純化選擇（ω= 0.41 679）。M1a與M2a比較分析未發現正向選擇位點[Bayes Empirical Bayes（BEB）analysis]。M7與M8比較分析發現了40個正向選擇位點，但未發現顯著的正向選擇位點[Bayes Empirical Bayes（BEB）analysis]。葡萄D組熱休克轉錄因子在進化過程中遭遇了純化選擇（ω= 0.63 930）。M1a與M2a比較分析發現了68個正向選擇位點，但未發現顯著的正向選擇位點[Bayes Empirical Bayes（BEB）analysis]。M7與M8比較分析發現了68個正向選擇位點，但未發現顯著的正向選擇位點[Bayes Empirical Bayes（BEB）analysis]。

2.4葡萄Hsf家族基因在不同非生物脅迫下的表達

利用前人研究的基因芯片表達譜數據，對在4 ℃低溫脅迫處理1 h與4 h的葡萄莖中葡萄熱休克轉錄因子基因的表達變化進行了分析，數據來源為plexdb數據庫與NCBI數據庫，GEO Accession為GSE31594（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi？acc=GSE31594）。結果顯示，在4 ℃低溫脅迫處理1 h葡萄莖中，有9個（VIT_218s0001g10380、VIT_211s0016g02010、VIT_211s0016g03940、VIT_205s0020g04090、VIT_202s0025g04170、VIT_205s0029g00340、VIT_210s059 7g00050、VIT_204s0008g01110、VIT_210s0003g01770）

葡萄熱休克轉錄因子基因上調2.0倍以上，其中8個（VIT_218s0001

2.5葡萄Hsf家族基因啟動子的順式作用元件

利用在線軟件PLANTCARE分析了葡萄熱休克轉錄因子家族基因的啟動子序列（起始密碼子上游1 500 bp），結果顯示大部分的葡萄熱休克轉錄因子家族基因的啟動子含有順式作用元件LTR（low temperature responsive），與低溫誘導相關。大部分的葡萄熱休克轉錄因子家族基因的啟動子含有順式作用元件MBS element（MYBbinding drought inducible），與MYB轉錄因子結合和干旱誘導相關。部分葡萄熱休克轉錄因子家族基因的啟動子含有順式作用元件G-box，與bHLH轉錄因子結合相關。部分葡萄熱休克轉錄因子家族基因的啟動子含有順式作用元件HSE，說明可能有的葡萄熱休克轉錄因子基因的表達可能受熱休克轉錄因子調控。

2.6相關性分析顯示密碼子使用偏好性可能受到的影響

利用軟件CodonW1.4計算葡萄熱休克轉錄因子家族各成員基因的密碼子使用偏好性指數。通過指數發現，葡萄熱休克轉錄因子家族各成員基因存在密碼子使用的偏好性。很多葡萄熱休克轉錄因子家族各成員基因，例如VIT_200s0179g001基因中，編碼苯丙氨酸（Phe）的密碼子UUU的RSCU值為1.30，而編碼苯丙氨酸（Phe）的密碼子UUC的RSCU值為0.70。這說明UUU是高頻使用的密碼子，更被偏好使用。

葡萄熱休克轉錄因子家族外顯子的平均GC含量為47.37%，平均GC3s為47.45%，平均Fop為0.40 825，平均CAI為0.20 450，平均CBI為-0.02 605。

為進一步揭示密碼子使用偏好性，該研究分析了Fop、CAI、CBI與外顯子數目、外顯子GC含量、外顯子GC3s的相關性。結果表明，Fop與GC含量呈顯著正相關（r=0.70，P<0.01）（圖8a）；Fop與GC3s呈顯著正相關（r=0.76，P<

0.01）（圖8b）；Fop與GC含量與GC3s相關性較強，表明葡萄熱休克轉錄因子基因外顯子密碼子使用偏好性受突變壓力（GC含量）影響；而Fop與外顯子數目相關性不強（r=0.20，P<0.01）（圖8c）；CBI與GC含量呈顯著正相關（r=0.71，P<0.01）（圖8d）；CBI與GC3s呈顯著正相關（r=0.74，P<0.01）（圖8e）；CBI與GC含量與GC3s相關性較強，表明葡萄熱休克轉錄因子基因密碼子使用偏好性受突變壓力（GC含量）影響；CBI與外顯子數目相關性不強（r=0.17，P<0.01）（圖8f）；CAI與GC含量呈正相關，但相關性不強（r=0.28，P<0.01）（圖8g）；CAI與GC3s呈正相關（r=0.37，P<0.01）（圖8h）；CAI與外顯子數目相關性不強（r=0.24，P<0.01）（圖8i）。

3討論

該研究從全基因組范圍內鑒定葡萄熱休克轉錄因子家族，共找出20個葡萄熱休克轉錄因子家族成員。盡管利用擬南芥和葡萄熱休克轉錄因子家族成員構建的進化樹可以被分為4個大組，但是擬南芥熱休克轉錄因子家族只含有A、B、C共3組的成員[4]，而葡萄熱休克轉錄因子家族可以被劃分為A、B、C和D 4個大組。葡萄熱休克轉錄因子的分組和擬南芥稍有不同。多重序列比對結果顯示D組成員的主要結構域氨基酸序列與A、B、C組成員都略有差異。

葡萄熱休克轉錄因子各成員的基因結構相似，大部分由2個外顯子和1個內含子構成，結構較為單一。整個葡萄熱休克轉錄因子基因家族的49個外顯子中只有2個對稱外顯子。過多的對稱外顯子會造成外顯子的復制和重排[32-33]，說明葡萄熱休克轉錄因子基因結構相對比較穩定。不同亞組成員的motif具有特異的保守基序，說明不同的亞組成員可能存在功能差異。盡管各個亞組所受到的選擇壓力都為純化選擇，說明同一亞組成員之間的功能差異可能不大，但是通過檢測到的多個正向選擇位點，說明同一亞組成員之間的功能也可能存在分歧或新功能的出現。

在不同非生物脅迫（高溫和冷）處理下，不同葡萄熱休克轉錄因子基因的表達發生顯著變化，說明部分葡萄熱休克轉錄因子可能涉及高溫脅迫和低溫脅迫的耐受。在不同非生物脅迫處理下，不同葡萄熱休克轉錄因子基因表達量變化各有異同，也說明不同的葡萄熱休克轉錄因子可能參與了不同脅迫的耐受，即功能可能存在差異。這些基因在不同脅迫下表現出的表達差異可能與啟動子順式調控元件的差異相關，例如有的葡萄熱休克轉錄因子基因含有LTR元件，說明可能受到低溫的直接誘導。而有的含有順式調控元件，例如MBS、G-box，說明部分葡萄熱休克轉錄因子基因的表達變化可能是受到其他轉錄因子的間接影響。

密碼子使用偏好性研究顯示，葡萄熱休克轉錄因子家族各成員基因存在密碼子使用的偏好性，而這種偏好性可能是受突變壓力（GC含量）影響[34-35]。

4結論

該研究鑒定并分析了葡萄熱休克轉錄因子家族，一些葡萄熱休克轉錄因子基因在非生物脅迫下的表達模式顯示其在葡萄對環境壓力的響應中起到了作用。該研究結果為深入研究葡萄熱休克轉錄因子的功能提供了有用的信息。

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