黑曲霉發(fā)酵法輔助提取瞿麥黃酮及抗氧化活性研究

高晗 郭東會 張顯忠 郭亞新

摘要[目的]研究瞿麥黃酮的不同提取方法及抗氧化活性。[方法]采用黑曲霉固體發(fā)酵法、液體發(fā)酵法分別輔助提取瞿麥黃酮，與超聲提取瞿麥黃酮得到總黃酮含量進(jìn)行比較。通過測定瞿麥黃酮對羥基自由基、DPPH自由基的清除作用，對其抗氧化活性進(jìn)行研究。[結(jié)果]黑曲霉固體發(fā)酵法得到的瞿麥黃酮含量高于液體發(fā)酵法，兩者均高于超聲提取的瞿麥黃酮含量。瞿麥黃酮的提取物對羥基自由基、DPPH自由基有良好的清除作用，其IC50值分別為0.065和0.046 g/L。[結(jié)論]該研究為瞿麥黃酮的開發(fā)與利用提供了新方法。

關(guān)鍵詞黑曲霉；發(fā)酵；瞿麥黃酮；抗氧化

中圖分類號S567.23+9文獻(xiàn)標(biāo)識碼

A文章編號0517-6611（2017）32-0142-02

Study on Extraction of Flavonoids from Dianthus superbus Assisted with Aspergillus niger Fermentation and Its Antioxidant Activity

GAO Han，GUO Donghui*，ZHANG Xianzhong et al（College of Life Science，Taishan Medical University，Taian，Shandong 271016）

Abstract[Objective] The research aimed to study the different extraction methods of flavonoids from Dianthus superbus and its antioxidant activity.[Method]Aspergillus niger solid fermentation and liquid fermentation were used to assist the extracting of flavonoids from Dianthus superbus，and the content of them were compared with that by the ultrasonic extraction method.Its antioxidant activity of flavonoids from Dianthus superbus was analyzed by measuring the scavenging action of flavonoids on hydroxyl radical and DPPH radical.[Result]The content of flavonoids by Aspergillus niger solid fermentation was higher than that of liquid fermentation，both of them were higher than that of ultrasonic extraction.The extract of flavonoids from Dianthus superbus had good scavenging effect on hydroxyl radical and DPPH radical.The IC50 of scavenging hydroxyl radical and DPPH radical were 0.065 and 0.046 g/L，respectively.[Conclusion]The study provides a new method for the development and utilization of flavonoids from Dianthus superbus.

Key wordsAspergillus niger；Fermentation；Flavonoids from Dianthus superbus；Antioxidant

基金項(xiàng)目國家級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（201510439065）。

作者簡介高晗（1993—），女，山東聊城人，本科生，專業(yè)：生物制藥。*通訊作者，助理實(shí)驗(yàn)師，碩士，從事微生物生理生化研究。

收稿日期2017-09-20

瞿麥（Dianthus superbus）為石竹科草本植物，別名野麥、巨句麥等[1]，具有利尿通淋、破血通經(jīng)的作用[2]。瞿麥的化學(xué)成分主要為黃酮類和皂苷類物質(zhì)。有文獻(xiàn)報(bào)道從瞿麥的地上部分分離得到8種黃酮化合物以及環(huán)肽類化合物[3-4]。有關(guān)研究表明，黃酮具有抗氧化、抗癌、降血壓、調(diào)血脂等藥理作用，對人類的衰老、腫瘤和農(nóng)業(yè)發(fā)展具有重要的意義。近年來，對于總黃酮的提取方法有浸提提取法[5]、超聲提取法[6]、超臨界流體萃取法[7]、微波提取法、酶提取法[8]等，而有關(guān)發(fā)酵法輔助提取瞿麥黃酮的研究鮮見報(bào)道。該法通過微生物發(fā)酵法產(chǎn)生復(fù)合酶制劑并以之分解植物細(xì)胞壁中的木質(zhì)素、纖維素等大分子物質(zhì)促進(jìn)有效成分的浸出，較其他方法簡單、更有價(jià)格的優(yōu)勢。該試驗(yàn)采用微生物發(fā)酵法輔助提取瞿麥黃酮優(yōu)化其提取工藝，分析其抗氧化活性為瞿麥資源的開發(fā)與利用提供理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試材瞿麥購自安國市旭芳中藥材經(jīng)營有限公司，粉碎，過60目篩，60 ℃烘烤至質(zhì)量恒定后備用。黑曲霉由泰山醫(yī)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供。蘆丁由中國藥品生物制品檢定所提供。DTT購自Sigma公司；其他試劑均為分析純。

1.2儀器V-5100可見分光光度計(jì)，購自上海元析儀器有限公司；KQ-600VDV型雙頻數(shù)控超聲波清洗器，購自昆山市超聲儀器有限公司。

1.3方法

1.3.1瞿麥黃酮提取方法的優(yōu)化。

1.3.1.1黑曲霉固體發(fā)酵法輔助提取瞿麥黃酮。固體發(fā)酵培養(yǎng)基[9]：瞿麥10.0 g、麩皮10 g、蒸餾水35 mL，121 ℃滅菌20 min。將黑曲霉接入固體發(fā)酵培養(yǎng)基，于37 ℃、150 r/min恒溫振蕩搖床培養(yǎng)5 d。向培養(yǎng)后的瞿麥固體發(fā)酵瓶中加入65 mL 60%乙醇，30 ℃、45 Hz、功率為50%，超聲提取50 min。4層紗布過濾后，60%乙醇將液體定容至100 mL，即為黑曲霉固體發(fā)酵瞿麥中的提取液，放入冰箱備用。

1.3.1.2黑曲霉液體發(fā)酵法輔助提取瞿麥黃酮。液體發(fā)酵培養(yǎng)基[10]：瞿麥10.0 g、蛋白胨2.0 g、葡萄糖0.4 g、NaCl 1.0 g、蒸餾水100 mL，121 ℃滅菌20 min。將黑曲霉接入液體發(fā)酵培養(yǎng)基，于37 ℃、150 r/min恒溫振蕩搖床培養(yǎng)5 d。30 ℃、45 Hz、功率為50%，超聲提取50 min。3 000 r/min，離心10 min，取上清。60%乙醇將上清定容至100 mL，即為黑曲霉液體發(fā)酵瞿麥中的提取液，將提取液放入冰箱備用。

1.3.1.3超聲提取瞿麥黃酮。稱取瞿麥10 g，加100 mL 60%乙醇，30 ℃、45 Hz、功率為50%，超聲提取50 min。3 000 r/min，離心10 min，取上清。用60%乙醇將離心后的上清定容至100 mL，即為瞿麥黃酮的提取液，將提取液放入冰箱備用。

1.3.2黃酮濃度的測定。

1.3.2.1不同濃度蘆丁溶液的測定[11]。稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)樣品10 mg，用少量的60%乙醇溶解后，置50 mL容量瓶中，加60%乙醇稀釋至刻度，即為0.2 g/L的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。精密量取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL分別于10 mL容量瓶中，各加入5%的亞硝酸鈉0.3 mL，搖勻放置10 min，加入10%三氯化鋁0.3 mL搖勻，放置10 min，加入1 mol/L的氫氧化鈉2 mL，分別用60%乙醇稀釋至刻度，搖勻，放置10 min，于510 nm處測其吸光度。

1.3.2.2黃酮含量的測定[12]。分別將以上3種黃酮提取液1 mL加入10 mL容量瓶中，其他操作步驟按照“1.3.2.1”方法進(jìn)行。最終計(jì)算3種黃酮提取液的黃酮含量E（mg/g）。

E=A×C×V×10-3/W

式中，A為樣品液測黃酮稀釋的倍數(shù)，C為回歸方程中求得的黃酮量（mg/L），V為定容體積（mL），W為樣品重量（g）。

1.3.3瞿麥黃酮的抗氧化活性研究。

1.3.3.1瞿麥黃酮對羥基自由基的清除作用[13]。在10 mL試管中依次加入9 mmol/L Fe2+ 1 mL、8.8 mmol/L H2O2 1 mL，搖勻，靜置10 min；取不同濃度的樣品溶液2 mL，搖勻，靜置10 min，再加入9 mmol/L水楊酸-乙醇溶液1 mL，搖勻，靜置30 min，于510 nm處測其吸光值，其清除率計(jì)算公式為：

Q=（1-Ax-AjA0）×100%

式中，Q為羥基自由基的清除率（%）；A0為空白對照品溶液的吸光度值；Ax為加入不同黃酮濃度樣品的溶液吸光度值；Aj為不加水楊酸的吸光度值。

1.3.3.2瞿麥黃酮對DPPH自由基的清除作用[14]。取不同黃酮含量的樣品1 mL，與0.5 moL/L的DPPH溶液0.25 mL混合，加乙醇至10 mL，在暗處37 ℃放置20 min，于517 nm處測其吸光度，以乙醇為空白調(diào)零。黃酮對DPPH自由基的清除率的計(jì)算公式為：

I=（1-Ax-AjA0）×100%

式中，I為DPPH自由基的清除率（%）；A0為空白對照品溶液的吸光度值；Ax加入不同黃酮濃度樣品的溶液吸光度值；Aj為不加DPPH的吸光度值。

2結(jié)果與分析

2.1黑曲霉發(fā)酵法輔助優(yōu)化提取瞿麥黃酮的條件按“1.3.2.1”方法操作，用分光光度法獲得以蘆丁濃度為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)所得的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：Y=8.98x+0.027（R2=0.998）。根據(jù)回歸方程計(jì)算3種不同方法提取瞿麥黃酮的含量如圖1所示。

從圖1可以看出，黑曲霉固體發(fā)酵法輔助提取瞿麥黃酮得到的黃酮含量高于液體發(fā)酵法，黑曲霉發(fā)酵法輔助提取瞿麥黃酮得到的黃酮含量高于普通的超聲提取。黑曲霉固體發(fā)酵法輔助提取瞿麥黃酮得到的總黃酮含量達(dá)1.334 mg/g。此方法比廖志雄等[15]的超臨界流體萃取法高出 0.680 mg/g。此方法同時(shí)也為其他植物中黃酮的提取提供了理論依據(jù)。

2.2瞿麥黃酮的抗氧化活性研究

2.2.1瞿麥黃酮對羥基自由基的清除作用。由圖2可知，瞿麥黃酮提取液對Fenton體系產(chǎn)生的羥基有很好的清除作用，隨著瞿麥中黃酮提取液濃度的增加，對羥基自由基的清除能力也隨之增強(qiáng)。通過統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 19.0求出清除羥基自由基IC50值為0.065 g/L。表明瞿麥黃酮對清除羥基自由基具有較好的效果，有良好的抗氧化作用。

2.2.2瞿麥黃酮對DPPH自由基的清除作用。由圖3可知，在低黃酮濃度0.05～0.20 g/L時(shí)，隨著瞿麥黃酮濃度的增加對DPPH自由基清除能力隨之提高，但黃酮濃度到0.20 g/L之后對DPPH自由基的清除能力趨于平緩。通過統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 19.0求出清除DPPH自由基IC50值為0.046 g/L。表明瞿麥黃酮具有較強(qiáng)的清除DPPH自由基的活性。

3結(jié)論

該研究采用黑曲霉發(fā)酵法輔助提取瞿麥黃酮，不僅提高了黃酮的得率，還降低了生產(chǎn)成本。對比固體發(fā)酵和液體發(fā)酵2種方法發(fā)現(xiàn)，固體發(fā)酵優(yōu)于液體發(fā)酵，無論是液體發(fā)酵還是固體發(fā)酵均高于不用發(fā)酵直接超聲提取的瞿麥總黃酮含量；黑曲霉固體發(fā)酵法得到的總黃酮含量達(dá)1.334 mg/g。

通過微生物發(fā)酵方法提取黃酮比傳統(tǒng)方法超聲提取更有優(yōu)勢。瞿麥黃酮對清除羥基自由基具有較好的效果，對DPPH自由基有一定的清除能力，表明瞿麥黃酮具有很好的抗氧化作用，這為瞿麥的進(jìn)一步開發(fā)提供了有利依據(jù)。關(guān)于瞿麥黃酮的結(jié)構(gòu)還待進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)

[1]

李興廣，高學(xué)敏.瞿麥水煎液對小鼠妊娠影響的實(shí)驗(yàn)研究[J].北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2000，23（6）：40-42.

[2] 李建軍，涂裕英，佟菊貞，等.瞿麥等12味利水中藥體外抗泌尿生殖道沙眼衣原體活性檢測[J].中國中藥雜志，2000，25（10）：628-629.

[3] 廖志雄，余建清.瞿麥中總黃酮的含量測定[J].醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2006，25（5）：472-473.

[4] 劉晨，張凌揮，楊柳，等.瞿麥藥學(xué)研究概況[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39（33）：20387- 20388.

[5] 陽崇德，張秀賢.大黃素的藥理研究進(jìn)展[J].中國藥業(yè)，2003，12（3）：78-79.

[6] 郭立杰，蔡駿.大黃素抗腫瘤作用的研究進(jìn)展[J].腫瘤防治研究，2008，35（8）：605- 608.

[7] GOEL R K，DAS GUPTA G，RAM S N，et al.Antiulcerogenic and antiinflammatory effects of emodin，isolated from Rhamnus triquerta wall[J]，India J Exp Bid，1991，29（3）：230- 232.

[8] SHI Y Q，F(xiàn)UKAI T，SAKAGAMI H，et al.Cytotoxic and DNA damageinducing activities of low molecular weight phenols from rhubarb[J].Anticancer research，2001，21（4A）：2847- 2853.

[9] 戴四發(fā)，賀淹才.黑曲霉產(chǎn)纖維素酶系各組分特性及酶解條件[J].華僑大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2001，22（1）：65-69.

[10] 牛麗亞，劉宛玲，肖建輝，等.黑曲霉發(fā)酵法提取麥胚黃酮工藝的研究[J].食品工業(yè)，2015，36（11）：1-3.

[11] 高光躍，馮毓秀，秦秀芹.山楂類果實(shí)的化學(xué)成分分析及其質(zhì)量評價(jià)[J].藥學(xué)學(xué)報(bào)，1995，30（2）：138-143.

[12]王曉，張紅俠，王其亮，等.酶法提取山楂葉中總黃酮的研究[J].工藝技術(shù)，2002，23（3）：37-39.

[13] 黃紅英，鄧斌，蔣剛彪.苦竹葉總黃酮的超聲提取及其抗氧化研究[J].時(shí)珍國醫(yī)國藥，2009，20（6）：1443-1445.

[14] 勾明玥，劉梁，郭春枝.采用DPPH法測定26種植物的抗氧化活性[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2010，36（3）：148-150.

[15] 廖志雄，余建清.瞿麥中總黃酮的含量測定[J].醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2006，25（5）：472-473.