石蠟切片方法的改良

趙亞林 閆青地 馮佳佳 肖鋒 楊卓 王鳳茹 董金皋

摘要[目的]快速且安全高效制作石蠟切片。[方法]采用不同的方法，對植物材料進行透明和脫蠟以及包埋處理，把材料制成透明的玻片標本，利用正丁醇代替二甲苯作為透明劑和脫蠟劑，其他和傳統的石蠟切片方法相同。[結果]正丁醇既能與乙醇混合，又能與中性樹膠相融合；正丁醇作用相對較緩和，透明后的組織平整，沒有明顯的收縮、變形現象，并且不存在透明時間過長的問題，還減少了對實驗人員的傷害。[結論]該方法可以快速地制作石蠟切片，且安全有效。

關鍵詞石蠟切片；透明劑；正丁醇；花

中圖分類號S-03文獻標識碼

A文章編號0517-6611（2017）32-0006-03

Method Improvement of Paraffin Section

ZHAO Yalin，YAN Qingdi，FENG Jiajia，WANG Fengru*，DONG Jinggao* et al（College of Life Science，Agricultural University of Hebei/Key Laboratory of Plant Physiology and Molecular Pathology in Hebei Province，Baoding，Hebei 071001）

Abstract[Objective] The aim was to make paraffin section safely and fast.[Method] Different methods were used to transparent and dewax the plant material and embedding，and the material was made into a transparent glass slide，and the nbutanol could instead of xylene.The other steps were the same as the traditional paraffin section method.[Result] The nbutanol not only could be mixed with ethanol，but also could be mixed with neutral gum.The nbutanol was relatively gentle，could obtain transparent tissue after formation，had no obvious shrinkage，deformation and transparent problem of long time，and reduced the damage to experimental staff.[Conclusion] The method could make paraffin section safely and fast.

Key wordsParaffin section；Clearing agent；nbutanol；Flower

石蠟切片是植物或者動物組織學常規制片技術中最為廣泛應用的方法。在傳統的石蠟切片時，常采用二甲苯作透明劑和脫蠟劑。二甲苯的細胞學毒性主要體現在誘導線粒體解偶聯和氧化應激反應[1-2]，石蠟切片不僅用于觀察正常細胞組織的形態結構，也可以作為病理學和法醫學等學科用以研究、觀察及判斷細胞組織的形態變化的重要方法，而且也已相當廣泛地用于其他學科領域的研究中。教學中，光學顯微鏡下觀察切片標本多數是石蠟切片法制備的。活的細胞或組織多為無色透明，各種組織間和細胞內結構之間均缺乏反差，在一般光鏡下不易清楚區別；由于組織離開機體后很快就會死亡和產生組織腐敗，原有的結構形態會發生變化，因此，組織要經固定、石蠟包埋、切片、染色等步驟，以免細胞組織死亡，從而能清晰辨認其形態結構。

有關石蠟切片技術方法改進的研究較多，也有文獻報道利用葵酸丁酯作為透明劑[3]，經過長期的石蠟切片觀察，人們用正丁醇代替二甲苯作為脫水劑和透明劑，發現其具有軟化組織的作用，不易使材料變脆，有利于切出完整的蠟帶，使得切片的難度得到改善，并使石蠟切片技術逐漸擴展、滲入許多新領域，作為基礎技術提供有效的實驗或使用樣品。石蠟包埋組織切片還可用于細胞原位核酸分子雜交技術中，對材料中被雜交的DNA分子進行定位、含量分析或觀察基因表達水平；聚合酶鏈式反應（PCR）技術可用于固定、石蠟包埋組織的DNA分析[4]，使研究進入了分子水平，但這些技術在短期內尚不能做常規使用。石蠟切片的步驟復雜，要做出理想的石蠟切片，人們還需要從各步的細節著手并進行簡化[5]。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1植物組織。用鋒利的刀片切取新鮮的擬南芥組織材料，同時取材應注意以下事項：①應取新鮮的材料，動作迅速，避免擠壓損壞組織。②取材不易過老，否則切片有難度（過老的材料必須在滑走切片機上進行）；對縱切的材料適當多取材，如根尖、莖尖等。

1.1.2試劑與儀器。

由于石蠟切片的步驟繁多，所以每一步試劑的選擇都會對試驗結果產生重要影響。常將固定、脫水、透明、脫蠟、復水、染色等步驟在有蓋容器中進行；更換試劑時，動作要迅速，以減少空氣中的水分對試劑濃度的影響，也可避免切片吸收空氣中的水分而影響最終的制片質量，并且盡量減少切片上殘留的試劑，以降低試劑間的相互影響。主要儀器有石蠟切片機（AO）、恒溫加熱儀、磨刀機（Leica SP9000）、光學顯微鏡（OL-YMPUS IX71）。

1.2方法

1.2.1固定。

固定液的作用是使細胞的新陳代謝瞬時停止，并保持細胞或組織的形態構造及其內含物的狀態不發生變化，達到使組織變硬從而便于切片[6]，增強內含物的折光度，令細胞易于著色的目的，同時具有防腐作用。以新鮮配制固定液效果較好。固定的時間依材料的種類、性質、大小等而定。良好的固定劑，應是穿透力強，使細胞立刻致死，原生質全部凝固；不發生任何變形，增強折光率，并且不妨礙染色。固定時間過長或固定液濃度高會使組織變硬，減弱固定液對組織的滲透能力，造成組織中間部分固定不好[7]。

1.2.2脫水。

脫水劑是與水在任何比例下都能均勻混合的液體，脫水要徹底，以利于后續步驟操作。傳統所用的脫水方法是將材料靜置脫水，而經過改進的方法是將脫水容器放在搖床上進行，可使材料均勻充分脫水，既節約試驗時間，又可以提高工作效率。常用的脫水劑有乙醇、正丁醇等，在以正丁醇作為脫水劑時，應從低濃度到高濃度，以避免組織過度收縮帶來的不良后果；正丁醇可與水、乙醇相混合，而且也能溶解石蠟，所以兼具脫水和透明作用，不會引起植物材料過度收縮和硬化。

1.2.3透明。透明是脫水和透蠟的橋梁，其作用是使透明劑置換掉組織中的脫水劑，使得組織的折光系數增強。把脫水處理后的材料依次放在100%乙醇（2/3）+正丁醇（1/3）（30 min）、100%乙醇（1/3）+正丁醇（2/3）（30 min）、純正丁醇（30 min）透明劑中（表1），期間最好更換1次透明劑，使組織得到充分透明[8]，為后續浸蠟做準備。正丁醇用作透明劑的優勢是：其作用相對緩和，透明后的組織平整，沒有明顯的收縮、變形現象，并且不存在透明時間過長的問題。同時甲苯、香柏油等也常用作透明劑。在病理學上，也常常使用正丁醇代替二甲苯作為組織透明劑，也取得了理想效果[9]。

1.2.4浸蠟。

浸蠟是包埋劑取代透明劑的過程。把透明處理好的材料放在提前融化的石蠟中，恒溫箱溫度應調整至高于石蠟熔點2～3 ℃，配制體積比為1∶1的正丁醇-純石蠟混合液，使用純石蠟替換上一級溶液，每隔 12 h 換一次純石蠟溶液，共替換 3 次[10]。

1.2.5包埋。

傳統使用的方法是將充分浸蠟的材料倒入已事先疊好的牛皮紙紙盒中，石蠟凝固前要擺正材料方向，將包埋盒放入冷水中迅速冷卻備用；該試驗探索利用長方形金屬包埋框對組織進行包埋處理，包埋框的長度和寬度能夠進行調節，包埋前將金屬框放在平鋪的玻璃板上，將充分浸蠟的材料倒入已事先備好的金屬框架中，利用熱的解剖針擺正材料方向[11]。在石蠟完全凝固但未變硬之前取下金屬框對

包埋塊進行修塊處理，從而提高工作效率。

1.2.6切片、染色、封片。

調整切片機的厚度為10 μm，調節

刀口與蠟塊的距離、蠟塊的位置。將蠟帶置于多聚賴氨酸處理過的載玻片上，加蒸餾水展平蠟帶后于42 ℃展片臺上烤干。將玻片放入染缸，再將甲苯胺藍染液加入染缸至淹沒玻片，染色10 min，再用雙蒸水清洗玻片，42 ℃烘箱中烘干。正丁醇浸泡玻片2次，每次10 min，取出玻片，在載玻片干之前滴加加拿大樹膠，蓋上蓋玻片封片[12-14]。

2結果與分析

對擬南芥的花蕾固定結果見圖1。透明前后的擬南芥花見圖2。

利用3種方法分別對材料進行透明處理，并對最終的結果進行比較分析，發現改進的方法I透明效果較好，對后續材料的包埋和切片效果最理想，并且縮短了透明時間。

利用上述改進的方法對擬南芥花藥進行石蠟切片，正丁醇代替二甲苯作為透明劑和脫蠟劑，對不同發育時期擬南芥花進行切片[15-16]，同樣能夠做出完整的石蠟切片（圖3）。在保證試驗結果的同時，很大程度上降低了二甲苯對實驗人員的傷害，是一種理想的二甲苯替代物。

3討論

傳統使用的透明劑和脫蠟劑是二甲苯，二甲苯是一種有芳香氣味的刺激性、易揮發液體，有毒性，主要對中樞神經和植物神經有麻痹和黏膜刺激作用，并對人牙周組織造成傷害，二甲苯對女性月經及生殖結構也有影響，是一種潛在的致癌物質，對人體危害大[17-18]，廣大病理工作者一直在探索尋找二甲苯的代替物；正丁醇與二甲苯相比屬于低毒類化學藥品，除一次性吸入大量化學藥品會引起輕微的頭痛外，還沒有發現有其他毒性方面的報道[19]，為了保護實驗人員的安全，工作人員應注意佩戴口罩和手套等防護用具；同時，正丁醇屬于易燃液體，在使用時應注意通風透氣，以降低對工作人員的傷害。

同時利用甲苯胺藍作為染色劑，使組織的染色鮮亮，核質分明，結構清晰，克服了二甲苯作為透明劑時染色不佳的問題。擬南芥作為河北省植物生理與分子病理學重點實驗室研究的模式植物，花藥可以作為植物生殖生長的研究對象。該試驗只是利用改進的方法對擬南芥的花藥進行石蠟切片的處理，后期還將該方法應用于擬南芥的其他組織進行石蠟切片，以期獲得更多數據。

4結論

利用改進的方法對組織材料進行處理，不僅節省了試驗時間，同時降低了對實驗人員的傷害，提高了工作效率。但是對不同的材料處理所需的時間和方法也不盡相同，仍需進一步研究。該研究對擬南芥的花藥進行不同部位的石蠟切片[20]，利用正丁醇作為透明劑和脫蠟劑，大大降低了傳統透明試劑二甲苯對實驗人員的危害；利用包埋框對材料進行包埋處理，縮短了時間，并且提高了效率。用正丁醇處理材料，透明效果好，浸蠟充分，容易連續切片，脫蠟快速且干凈，組織結構保持完整。綜上所述，正丁醇可以作為一種相對安全有效的二甲苯替代物，應用于植物組織切片中。

參考文獻

[1]

MATTHEWS J B.Influence of clearing agent on immunehistochemical staining of paraffinembedded tissue[J].Clinical pathology，1981，34（1）：103-105.

[2] REVILLA A ，PESTANA C R，PARDOANDREU G L，et al.Potential toxicity of toluene and xylene evoked by mitochondrial uncoupling[J].Toxicology in vitro，2007，21（5）：782-788.

[3] LYON H，HOLM I，PRENT P，et al.Nonhazardous organic solvents in the paraffi nembedding technique：A rational approach[J].Histochemistry and cell biology，1995，103（4）：263-269.

[4] 劉宏，牛建新，韓曉燕.適合原位RT-PCR的石蠟切片制作方法[J]生物技術通報，2006（1）：58-60.

[5] 侯春春，徐水.淺析影響石蠟切片質量的關鍵因素[J].中國農學通報，2009，25（23）：94-98.

[6] 魏永敬 ，汪兆亮 .硬脂酸代替二甲苯透明在石蠟切片中的應用[J].西南軍醫 ，2007，9（1）：57-60.

[7] GREER C E，PETERSON S L，KIVIAT N B，el al.PCR amplifications from paraffinembedded tissues：Effects of fixative and fixation time[J].Am J Clin Pathol，1991，95（2）：117-241.

安徽農業科學2017年

[8] 林加涵，魏文玲，彭宣憲.現代生物學實驗（上冊）[M].北京：高等教育出版社，2001：87.

[9] 李海，鄧志勇，陳金珍，等. 正丁醇及乙醇在病理組織制片中的改進應用[J].實用醫技雜志，2008，15（31）：4389-4390.

[10] 鄭興峰.石蠟切片法中細長或薄片狀材料的包埋[J].生物學雜志，2003，20（4）：43-46.

[11] WANG J P，ZHANG J M.Manufaction of paraffin section on Chinese pulsatilla flower[J]. Journal of xinyang norma university（Natural Scienee Edition），2008，21（4）：573-576.

[12] 阮建波，何洪標，田宋先.快速石蠟切片的探討[J].實用醫學雜志，1994，10（6）：589-592.

[13] 帥煥麗，楊途熙，魏安智，等. 杏花芽石蠟切片方法的改良[J].果樹學報，2011，28（3）：536-539.

[14] 鄧利群.快速制作常規石蠟切片[J].湖北民族學院學報，2001，18（4）：59.

[15] 靳丹丹.晚蓮花芽分化形態發育以及相應時期生理生化的動態研究[D].鄭州：河南農業大學，2008.

[16] 劉艷，周杰，黃宜兵，等.組織學石蠟切片制作中固定方法的改良[J].生物學通報，2016，51（1）：47-51.

[17] 劉志敏，王春華，劉志勇，等.苯甲苯和二甲苯作業女工對月經及生殖結局的影響[J].天津醫學院學報，1994，18（3）：3-5.

[18] 程金霞，杜程悅.苯類化合物與牙周組織疾病關系的研究[J].職業與健康，2001，17（1）：8-9.

[19] 王慎.制作石蠟切片用正丁醇做組織脫水和透明劑的體會[J].甘肅中醫學院學報，1986，7（1）：2-3.

[20] 楊捷頻.常規石蠟切片方法的改良[J].生物學雜志，2006，23（1）：45-46.