獨腳金內酯商業化用于植物保護的潛力

侯文君 編譯

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獨腳金內酯商業化用于植物保護的潛力

侯文君 編譯

(上海市農藥研究所，上海 200032)

獨腳金內酯(SL)是一類天然的，也可合成的化合物，具有有趣的生物學特性以及用于農業的潛力。在過去幾十年中科學界一直很關注此類物質，并對其進行了大量的研究。研究已證實此類物質具有激素活性，能調節植物株形；是誘導寄生雜草種子萌發的刺激物；是寄生植物識別寄主植物的主要因素；是信號物質，有助于叢枝菌根真菌(arbuscular mycorrhizal fungi)識別和在植物根部定植。獨腳金內酯具有的多種生物學特性激發了科研人員研究和應用的興趣，特別是用于農業，最近農化公司也開始關注。然而，盡管獨腳金內酯具有以上諸多特點，但實際應用受到很多方面的限制，如從植物根分泌物獲取的量低，合成費用高，對非靶標的影響不明確，沒有專用的登記立法。根據使用類型，SL有不同的登記程序：⑴SL被用作植物激素或自殺性萌發的天然除草劑，可以按植物保護產品登記程序進行登記；⑵用作激活植物防御機制的化合物，以植物強壯劑進行登記；⑶用于植物促進營養吸收或營養的有效利用，以植物生物刺激劑進行登記。本文根據現有的知識討論獨腳金內酯未來實際應用潛力。

1 獨腳金內酯的發展現狀

最早被確定的SL為獨腳金醇(Strigol)、乙酸獨腳金內酯(Strigylacetate)，是在1996年從非獨腳金屬(spp.)寄生寄主——棉花根系分泌物分離得到的獨角金萌發刺激物。后來，從獨角金寄主，即高粱、玉米和黍稷的根系分泌物中鑒定出獨角金醇。自此，從一些寄主和非寄主植物的根系分泌物中分離得到許多其他的SL。它們是寄主和寄生物間互作的主要因素，如寄生物種子不能萌發，因此沒有此類刺激物寄生物無法進行寄生循環。這些物質對根寄生物種子萌發有很強的誘導作用，作用濃度為10－7~ 10－15M。寄生物在種子萌發后，黏附到許多種類植物的根部，獲得營養和水，致使作物受損。列當(spp.和spp.)是全寄生植物，寄生于全球重要的農作物上，如豆科作物、十字花科植物、向日葵、大麻、煙草和番茄。獨角金屬(獨角金)是半寄生植物，對谷類作物能造成巨大的損害，主要發生在撒哈拉沙漠以南地區。在只知道SL的萌發刺激特性后，人們提出一個有趣的問題，為什么植物會分泌使“敵人”定植于其體上的SL。因此，假設SL還具有除寄生識別外的功能。后來研究發現它們能誘導共生叢枝根真菌的菌絲分枝和孢子萌發，這證實了以上假設是對的，SL對植物具有有益的作用。叢枝根真菌為土傳專性共生菌，能使植物對有機磷和其他礦物的吸收增加，使植物持續生長。這些真菌滲入和定植于植物根部后，生長出高度分支的結構，被稱作叢枝，是營養交換點。叢枝根真菌要成功定植于寄主植物依賴于寄主植物根和真菌菌絲間聯系網絡的建立，這受SL的調節。雖然SL是叢枝根真菌識別寄主的重要信號，在SL的作用下大部分陸地植物形成共生體，但有一些非叢枝根真菌寄主，如擬南芥和白羽扇豆，也產生SL。從這2種植物中分離鑒定出的SL或其代謝產物為新穎類別激素，調節植物分枝。這表明SL可能在植物體內具有其他未知的功能，如對植物正常的生長和發育起一定作用。已有文獻報道發現SL具有激素功能。最近科技人員在研究它們對植物生長和發育的影響。已報道SL能促進一些作物和雜草的種子萌發，影響植物根的分支和次級生長，參與根瘤菌-豆科植物的相互作用。

2 農業應用的潛力

由于SL對數個生物系統有作用，科學家已努力開發這些化合物的實際應用，主要為農業用途。

2.1 寄生雜草的管理

最初提出的SL應用包括寄生雜草的管理，稱為“自殺性”萌發。如果寄生雜草種子在萌發后，在附近找不到寄主根，就只能存活很短時間。“自殺性”萌發策略的思路是在沒有寄主的情況下刺激寄生雜草種子萌發，然后萌發種子死亡。用此方法減少寄生雜草種子銀行可能是一個長期過程。在較長一段時間內都在嘗試此方法，但許多問題阻礙了其實際應用，這包括合成足量產品的費用高；化合物在土壤中難以遷移，因此難以接觸到許多種子；化合物不穩定。然而，新技術的出現(例如納米技術、生物技術、先進的傳遞系統)有可能解決這些問題。

2.2 生物肥料

SL有助于共生真菌和根瘤菌在作物根部定植，從農業的角度出發，SL可被作為“間接生物肥料”。叢枝根真菌在與植物共生關系中的主要作用為傳遞礦物營養，特別是磷肥。在全球的許多地區，土壤中此重要礦物營養素的濃度或可利用度有限，這嚴重影響植物的生長和健康。叢枝根真菌能提高磷肥的吸收，促進植物的生長。由于叢枝根真菌在植物獲取磷肥中具有重要作用，因此在磷肥有限的田間生長的植物根系分泌物比在磷肥充足的環境中植物根系分泌物對叢枝根真菌的刺激性更大。

2.3 植物激素

在發現SL能抑制植物腋芽生長后，進行了大量相關研究。研究發現SL也能影響植物根系構型，特別是分枝、次級生長、下胚軸伸長、根的生長、生節和種子萌發，主要和其他激素共同作用。這些激素協同作用使植物對溫度、遮陰、日長和營養的利用率等環境因素做出適宜的響應。SL的分泌率對土壤中的營養水平高度敏感，在低磷條件下，植物產生的SL增加很多。植物對SL生物合成和分泌具有強的調節作用，這可能是植物在不同的磷肥水平下莖和根生長和構型變化的機制。因此深入了解這些機制才可能在農業中實際應用SL來調節植物的生長和形狀，增加植物的適合度，以最好的狀態生長、發育。

3 獨角金內酯現有生產方法和受限因素

3.1 已知的天然獨腳金內酯

到目前為止，已從植物根系分泌物中分離和鑒定了約20個天然SL，此數量將會繼續增加。不同植物種類和同一作物的不同品種產生不同的SL和/或其混合物。所有已知的SL結構相似。此類物質的核心部分為三環內酯(ABC部分)，通過烯醇醚橋與丁烯酸內酯基團(D環)相連(圖1)。在天然SL中，5-脫氧獨角金醇(5DS)首次從百脈根()的根系分泌物中分離得到。5DS結構簡單，被作為其他Ss的常見前體。Solanacol首次從煙草的根系分泌物中分離得到，是番茄的主要SL之一。列當醇和其乙酸鹽是植物中最常見的SL。目前，SL一般為對ABC核心進行修飾的化合物，如avenaol，或缺少三環內酯的物質，如heliolactone或carlactone。目前有18個具有三環內酯(ABC環)和2′-構型丁烯酸內酯環(D環)的SL。天然SL分為2類：獨角金醇和列當醇衍生物，2類物質的B-C環連接的立體化學結構不同。獨角金醇類SL的C環為位(向上，8b構型)，而列當醇類SL的C環為位(向下，8b構型)。

3.2 天然獨腳金內酯的分離

每個植物每日的SL產量非常適中。對棉花幼苗進行的研究表明每株植物每天獨角金醇和乙酸獨腳金內酯平均分泌量分別為15、2 pg-1，然而要收集水培寄主植物根系分泌物需要能栽培許多植物的試驗裝置。此“天然”生產方法不適宜于SL的批量生產。已評估了擬南芥和水稻細胞培養懸浮液作為細胞工廠生產SL的能力。然而，雖然2個細胞品種都能夠生產和在培養基中釋放許多不同的SL，但是在此系統中收集大量的化合物不太可能，這是因為SL降解速度快，在培養基中不能積累。雖然沒有進一步擴大此系統規模，但試驗已表明植物細胞培養可能具有批量生產SL的潛能。從根系分泌物中分離SL很費力，需要色譜分離純化。此外，由于SL的結構和立體化學結構復雜，其有機合成還在攻克中，所以SL難以商業化或商業化價格非常高。最近，一些SL的生物合成的研究取得了重大進展，預期不久將會確定更多調控其他SL合成的基因，制定出切實可行的SL生物合成的代謝工程。SL是從全反式--胡蘿卜素經9-順式--胡蘿卜素合成，而中間體carlactone(圖1)被認為是其他SL的前體。原則上，通過選取適宜的微生物，經培養，生化合成SL是可能的，這些微生物的培養成本低，且在培養基中釋放生物合成化合物。依據目前有關SL作用機制和生物合成的知識和研究進展，可預見以生物代謝工程為可行的合成方法已為時不遠。這將為天然SL低成本大規模生產鋪平道路，可用于基礎或農業應用。此外，了解SL轉運組織的特性將有助于更好地了解SL在作物體內的功能，為調節SL釋放到土壤中提供可能性。

注：根據立體化雪構型，獨腳金內酯被分為2類：獨角金醇和列當醇類；Avenaol和heliolacone的結構特征與獨腳金內酯的相似，但二者是否屬于獨腳金內酯類還需要討論；Carlactone是獨腳金內酯生物合成前體。

3.3 作用機制和穩定性

SL在生物系統中活性高，而在土壤中不穩定。獨角金醇和其類似物中存在高反應活性的烯醇醚結構，故這些物質在堿性介質中易于水解，生成ABC-甲酰內酯和5-羥基丁烯羥酸內酯(D-OH)(圖2)。GR24(立體異構體混合物)為SL合成類似物，被用作大多數生測試驗的通用標準，pH 7時其半衰期為10 d，5DS約為1.5 d。在24 h內，5DS的衍生物甲?；h內酯的量迅速增加，再隨著時間的增加逐漸減少，這表明甲酰內酯可能被氧化和水解而進一步降解。相比較，5DS在32 ℃的丙酮中放置21 d其濃度沒有變化。SL在土壤中的不穩定性關系到其田間的應用，化合物不能在土壤中積累。而適當劑型能部分抑制化合物水解。SL類化合物制劑化的主要目標是調整化合物穩定(有效)和不穩定性(阻止積累和污染突然)間的尺度。最近，Kannan和Zwanenburg建議利用SL的不穩定性引入防除寄生性雜草的新概念，即在SL起效前分解此萌發刺激物，使種子不能萌發。他們在自然條件中應用硼砂和硫脲，促進SL的分解，使寄生性雜草種子不能發芽。

圖2 獨腳金內酯水解為2部分結構：甲酰基三環核和羥基丁烯羥酸內酯

4 合成生產的持續性

SL的合成正在經受挑戰，其不但費時也費錢。目前合成的SL用于農業還不可行。然而，正如Zwanenburg和Pospisil在最近的綜述中強調，SL的全合成是成功解析這些天然產品的最可靠和推薦的方法。天然的SL具有很復雜的結構，難以以克的數量級規模合成。數個天然SL全合成已完成，但其合成途徑包括數步反應，通常多于20步。為了研究SL對不同生化過程的影響，設計和制備了模型化合物。其先決條件為SL類似物的結構應比天然SL(更)簡單，但生物活性要保持最好。合成SL可被分成2大類：⑴類似物，其結構與典型的天然SL的非常相似；⑵模擬物，其結構更簡單，其生物活性類似于SL。

4.1 類似物

SL類似物在生測研究中具有重要作用。GR24是SL通用標準，以克數量級規模的立體異構體混合物生產，對映體的手性分離法和對映選擇性合成法也已被提出，但生產成本較高是其一劣勢。在GR衍生物家族(GR24是知名代表)(圖3)中，設計結構簡單、有生物活性化合物的思路導致GR5和GR7的合成，GR7被用作防治獨角金(S.asiatica)的自殺性萌發劑。此刺激劑以10 mg/L用于裝土壤的盒子中(對應于約750 g/hm2)。此類物質的穩定性再次成為重要問題。pH＜7.5，GR7的半衰期約為100 h；pH越大，穩定性越小。試驗表明pH和濕度對GR7和GR24刺激種子萌芽的作用有很強的影響。值得一提的是Nijmegen-1，此物質可從簡單的原材料，經較少幾步反應，較容易地合成，其萌發活性相當于GR24。已對Nijmegen-1進行了田間自殺性萌發試驗，建議用量為約6.25 g/hm2，費用約為100 000歐元/hm2。目前，高成本阻礙了SL技術在田間的實際應用。本著設計簡單而有活性分子的思路，得到了一系列從成本低的酮衍生來的類似物。盆栽試驗表明四氫萘酮衍生物(圖3)具有很好的效果。EGO10是吲哚基衍生的SL，從易得試劑經3步反應輕松地合成，被用作植物激素，調節植物分枝。在設計具有萌發活性的新的類似物中，一個氧原子被一個雜原子取代，成功合成了2類活性物質，即亞氨SL類似物和strigolactams。

注：GR24一般用作生測標準物，GR7和Nijmigen已用于田間，EGO10是吲哚基衍生物，模擬物為含有D環的結構簡單的化合物。

4.2 模擬物

被稱作“SL的模擬物”是缺少ABC骨架，但保留了通過醚或酯功能鍵連接到另一基團的D環的化合物。“模擬”一詞來自于化合物的活性與SL的相仿。由于結構簡單，活性高，此類物質被認為是具有農業應用前景的候選物。一類具有種子萌發刺激活性的模擬物在C-5有一個芳氧基取代基，由于主要抑制植物分枝所以被命名為“debranones”(植物不分枝活性的呋喃酮)。種子對debranones的反應中等，而對氯苯氧基物的活性最高。另一類SL模擬物在D環的C-5上有一芳酰氧取代基。這些SL模擬物對種子的萌發具有中等的刺激作用，但對彎管列當()和種子有顯著的活性。目前正在測試這些芳酰氧SL模擬物對植物分枝的抑制活性。報道C-2′為S-芳基，C-3′為甲基的一個SL模擬物有非常高的活性。有趣的是，同一研究人員合成了一個名為AR36的化合物，此物質結構為D環和非環不飽和鏈相連(圖3)。此物質對豌豆分枝具有高的抑制活性，但不誘導根寄生雜草種子的萌發。這個例子很好地說明了通過適宜的分子設計可使化合物保留有益的作用而去除有害的影響。也可以通過已有化合物的試驗庫來搜尋田間應用的新的、有效的、選擇性生物活性化合物。建立了基于酵母的高通量篩選系統，得到了與SL活性相當的潛在候選物。然而，只有獲得更多有關合成可行性、生產成本、毒性和土壤中持效性的信息后，它們才有可能應用于農業。

4.3 抑制劑

SL具有多種功能，搜尋簡單的SL興奮劑或拮抗劑可能也對基礎研究和農業應用具有一定的作用。參與SL生物合成的大部分酶已被知曉，生物合成抑制劑已被確定和成功應用。然而，探求感知抑制劑仍處于初級階段。到目前為止，所有確定的SL興奮劑具有D-環或其衍生結構，唯一例外的為cotylimide(CTL)，其結構不含有D環。適宜的抑制劑可能能很好地控制和調整SL的作用。

4.4 合成獨腳金內酯對根圍的影響，對環境的威脅、穩定性和其降解產物可能的影響

在SL被確定為植物激素后，大量的科學研究已表明SL的激素活性能控制多種植物性狀。一般來說，SL能使植物適應惡劣的土壤環境，許多科學著作提出把SL用于農業土壤中以增加作物產量。然而，SL對土壤固有的微生物群的影響未知。通過研究分子在不同pH水介質中的穩定性、光穩定性和副產物，預測先導化合物的生物降解性將會令人滿意。SL在土壤中不穩定，故在土壤中存留時間短，且不會積累。然而，是否SL水解產物會影響土壤微生物(土壤微生物的結構、豐度和功能)仍需要研究。

5 對非靶標的影響

由于可得到的SL量少，所以對其對非靶標影響的研究有限。其中，一些試驗研究了最大濃度為8.5×10-5的一系列濃度的GR24對非靶標的影響，結果為其抑制尖孢鐮刀菌()、核盤菌()和灰葡萄孢菌()等植物病原真菌徑向生長，促進菌絲的分枝。然而，此活性濃度遠大于植物根產生的天然SL的生理量。還需要進行許多完整而詳盡的生測試驗來研究SL的應用對多種非靶標生物的影響。要進行這些生測，就需要大量的化合物，化合物生產成本高使這類生物評估試驗沒有經濟可行性。

6 管 理

伴隨著農業用途的新的天然分子的發現，產生了新的科學問題、方法論難題和管理問題。對于未來如何管理新分子的使用，第一步要做得就是確定化合物的特性。鑒于以上提及的SL的生物特性，未來對其農業使用的監管可能會存在多種情況。因為這些化合物可以被用作植物保護產品、或植物強壯劑或生物刺激劑，所以會以不同的登記程序進行登記(表1)。

表1 根據農業用途對獨腳金內酯的分類

6.1 植物保護產品

SL可以在植物組織中遷移，且作用濃度非常低，根據這兩個典型的特點，可以以植物激素進行登記。此外，雖然SL不直接殺死寄生雜草種子，但當用于自殺性萌芽時，可能按天然除草劑進行登記。在以上兩種情況下，在歐洲就根據(EC)No.1107/2009號法規進行監管，包括對植物保護產品的上市，對活性物質、安全劑、增效劑和助劑(adjuvant and coformulant)的評估和授權。在植物保護產品上市前，要根據歐洲議會和理事會條例()評估其中的活性物質的安全性。除了對危害植物的生物具有防控作用外，活性物質和其在食物中的殘留不應該對人和動物的健康有危害，對環境和非靶標不會有不可接受的影響。這些分別是(EC)No.1107/2009號法規附件Ⅱ的3.6、3.7和3.8所要求的，也是No.544/2011號法規要求的，是評估化合物對人類健康影響、毒性和生態毒性，以及活性物質在環境中的行為和歸屬的程序。

要登記一個活性物質，生產者必須向成員國提交申請，付費以及提供活性物質滿足登記要求的一套完整資料。從提交申請到批準的公布約需要2.5~3.5年，根據登記所需資料的復雜性和完整性的不同，此時間的長短有很大的變化。植物保護產品至少含有一個被批準活性成分，在其上市或使用前，必須根據相關法規和程序被所在成員國授權。

根據歐盟不同國家特定的農業氣候特征，歐盟被分為3個區進行授權(南部、中部和北部)。成員國代表其所在區的其他國家對申請材料進行評估，有時代表所有區。與(EC)No.545/2011號法規要求的一樣，(EC)No.1107/2009號法規要求提交的植物保護產品的強制性數據有農藝效果、毒性和生態毒性和殘留研究。據筆者所知，到目前還沒有進行所要求的、必須的有關SL對水生(例如水藻、水蚤和魚)和陸生生物的急性毒性和慢性影響的試驗。植物保護產品登記和授權程序漫長而費力，需要許多專家的支持；此外，生產者必須向主管機構提供大量產品信息以供評估和授權，故花費很高。低影響的產品登記費用為數十萬歐元，新的復雜的產品需花費幾百萬歐元。

6.2 植物強壯劑

SL對植物種子具有獨特的作用機制，也被用作植物強壯劑。其定義為激發植物的防御機制，保護植物免受有害生物的危害，但也能保護植物不被非寄生性生物侵害。植物強壯劑是界于肥料和植物保護產品間的物質，沒有明確適用的歐洲登記法律。目前，不同的國家對其有不同的命名，以適用于植物保護產品的(EC)No.1107/2009號法規或監管肥料的(EC)No.2003/2003號法規進行管理。此外，一些成員國已制定了允許此類產品用于農業的法規，其他一些國家甚至把植物強壯劑歸為化妝品和食品添加劑的管理范疇。在與成員國合作的情況下，EC Service詳細指定了“低風險植物強壯劑的數據要求”工作文件，這有助于明確植物強壯劑的授權程序。根據此文件，首次評估對人類、動物和環境風險低的植物強壯劑時，需提交的資料很少。如果首次評估認為此產品可行，根據實際情況可能需要提供進一步的信息。然而，有關肥料的(EC)No.2003/2003號法規正在修訂中，此次修訂主要是要擴展所適用肥料的范圍，包括植物生物刺激劑，植物強壯劑也可歸入植物生物刺激劑類中。

6.3 植物生物刺激劑

植物生物刺激劑被定義為當用于植物或根圍，會刺激植物的天然生理過程，有利于營養的吸收，增加營養利用率、對非生物脅迫的耐性，提高作物的品質。此類物質不屬于植物營養成分，也不是具有公布的和特定的植物健康功能的產品。最近對不同國家對此類物質的管理進行了調查，發現不同國家間存在相當大的差異。例如在一些國家，植物生物刺激劑的上市無需授權，而大多數國家要求提交毒性、生態毒性、風險評估、農藝效果和分析方法等詳細的材料。歐盟新法規要求，由第三方對提交的植物生物刺激劑材料進行評估。因此，不久以后，如果在歐盟把SL登記為植物生物刺激劑的話，要由評估單位對SL進行評估。利益相關者要提交確定活性物質，證明防效、無害性的試驗材料。然而植物生物刺激劑的管理程序一般比植物保護產品的簡單。歐盟肥料新法規還沒有生效，植物生物刺激劑的上市將會遭遇國家立法，且不同國家所立法規會不同。

7 總 結

SL真正用于農業的道路還很漫長，而且充滿荊棘。而新穎技術和生物技術的出現，農化公司的興趣和投資的不斷增加，有力的、振奮人心的科研結果的獲得，都將可能縮短SL的商業化進程。最近評估了一些SL的抗癌特性，SL將在醫藥等領域的應用可能會激勵此類物質的農業用登記。

10.16201/j.cnki.cn31-1827/tq.2017.02.04

TQ450

A

1009-6485(2017)02-0020-06

侯文君，女，工程師，碩士。E-mail: sjnywp@163.com。

2017-04-10。