赤霉酸GA4+7提取預處理酶法工藝研究

趙 南，劉義雄，徐永華，周金龍，宋革命，徐 勇

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赤霉酸GA4+7提取預處理酶法工藝研究

趙 南，劉義雄，徐永華，周金龍，宋革命，徐 勇

(江西新瑞豐生化有限公司，江西新干 331300)

考查復合酶預處理工藝在赤霉酸GA4+7提取生產中的應用效果。GA4+7發酵液提取預處理工藝，采用復合酶酶解替代傳統的重金屬鹽類絮凝，配合后續工段的調整，形成完整的赤霉酸GA4+7提取新工藝。相比傳統工藝，新工藝提取收率增幅達23.3%，極大提高產品的收率水平，適用于工業化生產。

赤霉酸GA4+7；預處理；復合酶

赤霉酸GA4+7屬赤霉素類植物生長調節劑，是GA4和GA7的混合物，其對于植物的生理學功能與GA3不同。在100多種赤霉素同系物中，GA4+7和GA3更具使用價值和商業價值，尤以前者為甚[1]。目前GA4+7產品在國內和歐美一些國家有著較廣泛的應用。隨著其應用領域的不斷拓展，GA4+7產品的市場容量亦逐步擴大。

在工業微生物領域，發酵液往往需經過預處理后進入下游提取[2-3]。常見的預處理手段有調節pH等電點法，加鹽絮凝沉降蛋白法，助濾劑(如硅藻土、珍珠巖粉)法，絮凝劑聚合法等。對于赤霉酸類GA3發酵液預處理，中科院趙彥修等[4]通過添加硫酸鋁獲得良好的效果，此外調節pH等電點法應用也較為普遍。而赤霉酸類GA4+7發酵液組分與GA3相比差異較大，目前通行的預處理工藝是采用黃血鹽、硫酸鋅2種鹽類協同作用使料液產生絮凝以實現固液分離。該工藝的特點是濾液清澈、過濾速度快。但同時存在較大缺陷，即鹽類本身對產品產生的破壞，加之絮凝結團易導致菌絲內產品釋放受阻，頂洗不徹底，影響收率；添加鹽類后極大提高濾液滲透壓，無法應用先進的膜分離工藝進行下游濃縮，只能選擇落后的薄膜蒸發工藝；后者工作能耗大，料溫高(50 ℃左右)，產品易受熱被破壞；濾渣內富含重金屬物質，存在環保問題。

本研究擬建立全新的酶法預處理工藝，以提高收率，更新濃縮方式，解決環保等問題。

1 材料與方法

1.1 材料

赤霉酸GA4+7發酵液，江西新瑞豐生化有限公司生產；纖維素酶、溶菌酶、酸性蛋白酶，市場購買；中速定型性濾紙，市場購買；722N可見分光光度計，上海精密科學儀器有限公司；中試納濾膜設備ZNF2540L-1，廈門征成膜清洗科技有限公司；納濾膜芯NF-90(分子量200)，廈門征成膜清洗科技有限公司；高效液相色譜儀LC-10ATVP，日本島津。

1.2 方法

1.2.1 復合酶及作用條件的確定

用正交試驗法[5]研究了復合酶的最佳組合以及最適作用pH。

1.2.2 濾速測定

以單層中性定性濾紙作為介質，自然過濾5 min，收集濾液，計量體積作為濾速參數。

1.2.3 濾液質量測定

用722N可見分光光度計在666 nm波長條件下，以蒸餾水空白歸零修正，測定濾液吸光值，濾液質量與其呈負相關關系。

1.2.4 納濾膜分離濃縮方法

將NF-90納濾膜芯安裝于小試膜設備上，成一納濾系統。濾洗液過膜，控制進膜壓力16~18 bar，出膜壓力13.7~15.3 bar，透析液為水及小分子物質，棄去。回流液內含產品重回原料儲罐中循環處理，達到濃縮目的，當其體積為初始濾液體積1/6左右時，終止納濾，收集濃縮液。計量體積，檢測濃縮液含量，考查收率。

1.2.5 HPLC測定含量

StableBond C18反相柱；柱溫：35 ℃；檢測器：UV 210 nm；流動相：甲醇67%、水33%、甲酸0.05%；流速：0.7 mL/min；進樣體積：20 μL。進樣濃縮液，測定GA4+7的含量。

2 結果與分析

2.1 復合預處理酶的選型及配伍組分比例確定

赤霉酸GA4+7發酵液內固形物組分主要為目標產物、菌絲體(內含胞內物質及部分目標產物)、培養基殘料(蛋白質、糖類、無機鹽等)。選擇纖維素酶、溶菌酶作用于菌絲體，促其破壁釋放目標產物。殘料中蛋白質具有一般膠體性質，選擇酸性蛋白酶對培養基殘料中蛋白質進行適度水解，使其絮凝沉降成為濾渣。本研究在常溫、復合酶添加比例0.05%，酶解1 h的條件下預處理GA4+7發酵液，以原工藝(加鹽絮凝)為對照，考查新工藝的濾速、濾液質量、效價等指標，確定最優預處理復合酶配方。

2.1.1 正交試驗

設定纖維素酶、溶菌酶、酸性蛋白酶、pH作為4個因素，復合酶總量按6份計，各因素以1份、2份、3份設定3個水平，pH分別設定4.0、5.0、6.0 3個水平。對4個因素進行正交試驗(表1)。

表1 正交試驗

注：對照效價以100%計，以下該指標數據處理與此相同。

表2 結果統計

表2數據表明，當將發酵料液pH控制在6.0時，各項指標數據均處于最高水平；就核心指標效價而言，纖維素酶3份、溶菌酶1份、酸性蛋白酶2份配伍組合效果最優；與對照組相比，各組合對濾速、濾液質量的影響并不明顯；根據各因素隨水平變化表現的趨勢看，纖維素酶可在上限基礎上適當增加比例，溶菌酶可在下限基礎上適當減少比例，酸性蛋白酶于2水平處效果最優；經修正后，確定酶解pH 6.0最適控制點，復合預處理酶配伍組合為纖維素酶52%、溶菌酶33%、酸性蛋白酶15%。

2.1.2 配方效果驗證

將上述配制復合酶添加于發酵液中酶解，與對照鹽析預處理工藝進行對比，結果見表3。

結果表明酶解預處理工藝具有良好的增產效果，同時對過濾工序的運行工效及濾液質量并未產生不利影響。

2.2 復合預處理酶添加比例確定

在確定復合酶配方基礎上，通過添加系列梯度用量復合酶進行小試，考查收率、濾液質量等指標，確定適用于生產實際的最佳復合酶用量。

表3 酶解工藝與原工藝效果對比

表4 復合酶梯度用量小試研究

由表4可知，復合酶添加用量為0.08%時，在保證過濾工序進度和濾液質量的前提下，能大幅提高過濾工序的收率水平。

2.3 下游濃縮工藝重建

傳統濾液因富含鹽類，滲透壓較高，故選擇薄膜蒸發法濃縮。但此法50 ℃左右的高溫對產品有一定程度的破壞，且能耗較大，運行成本高。由復合酶替代鹽類進行發酵液預處理后，濾液滲透壓大幅降低，可應用先進的膜分離工藝進行下游濃縮。通過考查納濾透析通量變化、工作時間、濃縮倍數、工段收率等指標，評估納濾膜分離的濃縮效果。

2.3.1 納濾膜濃縮運行功效考查

復合酶預處理后，收集板框濾液，采用中試納濾膜分離系統進行分離濃縮。以物料濃縮至6倍作為控制終點，監測期間通量變化，同期以自來水進膜分離為對照，確定納濾膜分離的濃縮適用性。結果見圖1、圖2。

2.3.2 納濾濃縮對收率的影響

將同一板框濾液均分2組，分別采用納濾分離、薄膜蒸發2種方式進行濃縮，結果見表5。

由表5可知，相比傳統薄膜蒸發法，納濾分離工藝無論是運行工效，還是技術指標都具有明顯優勢。

表5 納濾、薄膜蒸發工藝濃縮效果及收率比較

圖1 濃縮液體積隨時間變化趨勢

圖2 通量隨時間變化趨勢

2.4 新工藝整合后試產驗證效果及對技術指標的影響

整合以上試驗結果形成完整工藝體系，并應用于工業化試生產，同時采用原工藝作為對照，連續8批次驗證結果見表6。

表6 新工藝試生產水平驗證

由表6可見，應用復合酶預處理結合納濾濃縮工藝能極大提高板框、濃縮二工段收率，后續工段無異常，對總收率水平的提升效果明顯。之后各批成品檢測數據顯示，所有批次產品質量指標均符合標準要求，進一步證明新工藝適用于規模化生產。

3 結 論

預處理酶作為一種具有催化能力的蛋白質，應用于工業微生物提取領域是創新式嘗試，并獲得了良好的試驗效果。本文針對赤霉酸GA4+7收率水平不高的瓶頸問題，通過酶法研究，篩選出預處理復合酶最優組合，即纖維素酶52%、溶菌酶33%、酸性蛋白酶15%，確定了適宜的處理條件pH 6.0及0.08%的添加比例。通過酶解作用，促進菌絲體內目標產物充分釋放，改善發酵液流變狀態，利于后提取工序順暢銜接，在提高產品總收率、降低單位生產成本的同時能夠對原有工藝體系進行重建，淘汰落后的高能耗生產方式，避免了鹽析濾渣產生的重金屬污染問題，最終實現經濟效益、能源效益、生態效益的全面提高。通過酶法工藝產生的板框濾渣富含蛋白質等營養物質，后續研究將對內含物質進行組分分析，探索建立適宜的加工方法，把濾渣處理成為符合相關要求的動物飼料或作物有機肥，變廢為寶，推動赤霉酸GA4+7循環經濟進一步發展。

[1] 顏方貴, 秦杰, 何增國, 等. 赤霉素A4、A7的研究進展[J]. 微生物學通報, 1994, 21(3): 163.

[2] 俞俊堂, 唐孝宣, 鄔行彥. 新編生物工藝學[M]. 北京: 化學工業出版社, 2009: 1－21.

[3] 俞文和. 新編抗生素工藝學[M]. 北京: 中國建材工業出版社, 1996: 10－23.

[4] 趙彥修, 張露茜. 赤霉素發酵液的絮凝預處理研究[J]. 微生物學通報, 1994, 21(1): 3－5.

[5] 廖永平. 質量管理常用統計技術與方法[M]. 北京: 中國科學技術出版社, 1999: 198－204.

Study on the Effects of Enzyme Pretreatment on Extraction of GA4+7

ZHAO Nan, LIU Yixiong, XU Yonghua, ZHOU Jinlong, SONG Geming, XU Yong

(Jiangxi New Reyphon Biochemical Ltd., Xingan 331307, Jiangxi, China)

The effect of pretreatment technology with complex enzyme on gibberellinGA4+7 extraction was investigated. The extraction pretreatment process of the gibberellins GA4+7 fermentation broth changes from the traditional heavy metal salts flocculation to the complex enzyme hydrolysis, combined with the subsequent section adjustment, and is a new gibberellins GA4+7 extraction technology.Compared with the traditional process, the extraction yield increased by 23.3%.The new technology can greatly improve the yield of products, and is suitable for industrial production.

gibberellins GA4+7; pretreatment; compound enzyme

10.16201/j.cnki.cn31-1827/tq.2017.02.07

TQ450

A

1009-6485(2017)02-0034-04

江西省優勢科技創新團隊建設計劃項目(20152BCB24012)

趙南(1973—)，高級工程師，江西南昌人，從事工業微生物菌種、發酵、提取研究。

2017-03-08。