Aurora-B靶向抑制劑AZD1152抑制宮頸癌Hela細胞增殖和誘導細胞凋亡的研究

Aurora-B靶向抑制劑AZD1152抑制宮頸癌Hela細胞增殖和誘導細胞凋亡的研究

胡夢川

目的探討Aurora-B靶向抑制劑AZD1152抑制宮頸癌Hela細胞增殖和并誘導細胞凋亡的作用。方法將細胞按照AZD1152濃度分為6組，分別為：正常對照組，20μmmol/L組，50 μmmol/L組，100 μmmol/L組，200 μmmol/L組，500 μmmol/L組。采用MTT法檢測各組細胞增殖，酶聯免疫分析儀檢測各組OD值；采用TUNEL法檢測各組細胞凋亡，倒置顯微鏡觀察細胞凋亡，并計算凋亡率。結果MTT法檢測細胞增殖，實驗組和對照組比較，相同培養時間不同抑制劑濃度，OD值隨著AZD1152濃度增加而降低，與對照組比較，差異有統計學意義（P＜0．05）；相同抑制劑濃度，不同培養時間，OD值隨著培養時間延長而降低，與對照組比較，差異有統計學意義（P＜0．05）。TUNEL法檢測細胞凋亡，實驗組和對照組比較，相同培養時間不同抑制劑濃度，隨著AZD1152濃度增加，細胞凋亡率增加，與對照組比較，差異有統計學意義（P＜0．05）；相同抑制劑濃度，不同培養時間，隨著培養時間延長，細胞凋亡率增加，與對照組比較，差異有統計學意義（P＜0．05）。結論Aurora-B靶向性抑制劑AZD1152可以顯著抑制宮頸癌Hela細胞增殖，同時顯著促進宮頸癌Hela細胞凋亡。

Aurora激酶；AZD1152；宮頸癌；增殖；細胞凋亡

[Keywods]Aurora kinase; AZD1152; cervical cancer; proliferation; apoptosis

宮頸癌是女性常見疾病，是嚴重影響女性健康的惡性腫瘤之一[1]。對于晚期宮頸癌患者使用單一姑息手術治療存在一定局限性，目前均采用藥物化療聯合放療的辦法，尤其是分子靶向治療越來越受到重視，所以尋找并選擇適合、敏感的藥物治療靶點成為近年該領域的研究熱點[2]。近年的研究發現，Aurora激酶與人類腫瘤關系密切，其中Aurora-B參與染色體調節、分離，在紡細胞增殖方面發揮重要作用，其在細胞增殖和分裂中起到了重要作用[3]。本研究分析了Aurora-B靶向抑制劑AZD1152抑制宮頸癌Hela細胞增殖并誘導細胞凋亡的作用，以探討Aurora激酶與宮頸癌Hela細胞增殖和凋亡的關系。

1 材料和方法

1.1 材料

Hela細胞株由中國科學院上海細胞庫提供。RPMI1640培養液（美國Gibco公司）；小牛血清（美國Gibco公司）；胰蛋白酶細胞消化液（武漢百浩天公司），細胞培養用青霉素，鏈霉素（江蘇碧云天公司）；MTT試劑盒（美國sigma公司）；ELx800酶聯免疫分析儀（美國biotek公司）；TUNEL細胞凋亡試劑盒（瑞士羅氏公司）。AZD1152（美國Sigma公司）；5% CO2飽和濕度細胞培養箱（日本三洋公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養和試劑配置 Hela細胞常規培養于RMPI1640培養液中，內含小牛血清100 ml/L，青霉素、鏈霉素105U/L，置于37 ℃，飽和濕度細胞培養箱中，每2天換液、傳代，取對數生長期的細胞進行實驗。AZD1152使用二甲基亞砜溶解，稀釋成10 mmol/L的儲存液備用。

1.2.2 MTT法檢測細胞增殖 將培養細胞調整計數為3×107/L，接種于96孔無菌細胞培養板中，每孔量為100 μl，每組設6個孔，邊緣孔用無菌PBS液填充，于細胞培養箱中孵育12小時備用。根據預實驗的結果，將儲存液稀釋成為6組，20 μmmol/L組、50 μmmol/L組、100 μmmol/L組、200 μmmol/L組、500 μmmol/L組和正常對照組，加入培養板中，培養時間分別為24 h、48 h、72 h。待各組孵育后，倒置顯微鏡下觀察細胞培養情況。加入100 μl MTT染色液，繼續培養4 h。棄去上清，加入150 μl二甲基亞砜，水平震蕩10 min，待溶液中的紫色結晶全部溶解后，置于酶聯免疫分析儀上檢測，使用570 nm濾光片檢測，記錄每組OD值進行比較，OD值越大表明細胞增殖越顯著。

1.2.3 TUNEL法檢測細胞凋亡 各組細胞完成培養后，胰蛋白酶消化，吹打成細胞懸液，離心，用無菌PBS洗滌2次后，將細胞均勻的涂于載玻片上，干燥后使用多聚甲醛固定，使用TUNEL原位檢測試劑盒檢測細胞凋亡，按照試劑盒說明書操作。使用DAB染色，蘇木素復染，在倒置顯微鏡下觀察，每個玻片觀察5個視野，每個視野分別計數凋亡細胞數和細胞總數，計算細胞凋亡率。凋亡率=凋亡細胞數/細胞總數×100%。

1.3 統計學方法

采用SPSS 13.0統計軟件進行統計分析，計數資料采用率或者百分比表示，采用χ2檢驗；計量資料以（均數±標準差）表示，組間數據采用one-way ANOVA進行統計學分析，以P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 MTT法檢測Hela細胞增殖

倒置顯微鏡下觀察，Hela細胞貼壁生長，大部分呈短梭形，部分呈不規則形。各組細胞經過OD值檢測，實驗組和對照組比較，相同培養時間不同抑制劑濃度，OD值隨著AZD1152濃度增加而降低，與對照組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；相同抑制劑濃度，不同培養時間，OD值隨著培養時間延長而降低，與對照組比較，差異有統計學意義（P＜ 0.05）。見表1。

2.2 TUNEL法檢測細胞凋亡

細胞核染成深褐色為陽性凋亡細胞，陰性細胞核染成淡藍色，各組細胞凋亡陽性率，見表2。

3 討論

宮頸癌是婦科最常見的惡性腫瘤，好發年齡在30 ～ 50歲。目前治療多綜合考慮制定個性化治療方案，一般采用手術結合放療、化療的綜合治療方案。全身情況不適合手術患者或者不愿接受手術治療的患者，采用放療方案[4]。而對于晚期或者復發的患者，近年來多采用靜脈或動脈灌注化療，以縮小腫瘤病灶及控制亞臨床轉移，也用于放療增敏[5-6]。目前的化療多采用BVP方案（博來霉素、長春新堿與順鉑），BP方案（博來霉素、順鉑）等[7]，對于晚期腫瘤患者，副作用較大，有時難以耐受。所以，尋找新的藥物作用靶點，開發副作用較少的藥物是這一領域的新方向。

Aurora激酶是一組調控細胞有絲分裂的絲/蘇氨酸激酶，在中心體復制、兩極紡錘體的形成、染色體的重排和染色體檢查點的監測等重要的有絲分裂事件中發揮重要作用。目前已經發現Aurora激酶有3個成員，Aurora-A、Aurora-B和Aurora-C，其中Aurora-B在有絲分裂早期位于染色體的著絲粒區域，分裂后期則從著絲粒移動到微管。近年研究發現，Aurora-B在許多腫瘤組織中高表達，如：乳腺癌、胰腺癌、卵巢癌等，其與抑制腫瘤細胞的凋亡密切相關[8-9]。Aurora-B已經作為目前潛在的腫瘤治療靶點，并且已經成為研究者們的研究熱點。

本研究選用宮頸癌細胞株Hela細胞為研究對象，使用Aurora-B特異性抑制劑AZD1152與細胞共培養，觀察各實驗組Hela細胞增殖和細胞凋亡的變化，并與對照組進行統計學分析，從而探討Aurora激酶在宮頸癌Hela細胞增殖和凋亡過程中的作用。我們采用MTT法檢測細胞增殖，實驗組和對照組比較，相同培養時間不同抑制劑濃度，OD值隨著AZD1152濃度增加而降低，與對照組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；相同抑制劑濃度，不同培養時間，OD值隨著培養時間延長而降低，與對照組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。采用TUNEL法檢測細胞凋亡，實驗組和對照組比較，相同培養時間不同抑制劑濃度，隨著AZD1152濃度增加，細胞凋亡抑制率增加，與對照組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；相同抑制劑濃度，不同培養時間，隨著培養時間延長，細胞凋亡抑制率增加，與對照組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。

本實驗結果提示：Aurora-B特異性抑制劑AZD1152可以顯著抑制宮頸癌Hela細胞增殖，同時顯著促進宮頸癌Hela細胞凋亡。進一步證實Aurora激酶家族中Aurora-B在宮頸癌細胞Hela細胞的增殖和凋亡中起到了重要作用。

表1 各組Hela細胞不同培養時間增殖力檢測 （）

表1 各組Hela細胞不同培養時間增殖力檢測 （）

注：采用one-way ANOVA檢驗，與對照組比較，*P＜0．05

分組 24 h 48 h 72 h空白對照組20 μmmol/L組50 μmmol/L組100 μmmol/L組200 μmmol/L組500 μmmol/L組0．578±0．039 0．516±0．042 0．463±0．021*0．381±0．018*0．327±0．022*0．236±0．037*3．636 0．034F P0．706±0．042 0．492±0．055 0．423±0．034*0．305±0．026*0．237±0．029*0．202±0．052*4．863 0．017 0．824±0．032 0．422±0．054*0．367±0．044*0．295±0．052*0．202±0．041*0．164±0．036*5．690 0．007

表2 各組Hela細胞不同培養時間細胞凋亡百分比檢測（%）

參考文獻

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Inhibition of Proliferation and Apoptosis of Cervical Cancer Hela Cells by Aurora-B Targeting Inhibitor AZD1152

HU Mengchuan Department of Obstetrics and Gynecology, Xili People's Hospital at Nanshan District, Shenzhen Guangdong 518055, China

ObjectiveTo explore the anti-proliferative and apoptosis induction effects of AZD1152, specific inhibitor of Aurora-B, on Hela cells.MethodsHela cells were divided into six groups through preliminary experiment based on the concentration of AZD1152, normal control group, 20 μmmol/L group, 50 μmmol/L group, 100 μmmol/L group, 200 μmmol/L group and 500 μmmol/L group. Proliferation of Hela cells was detected by 3-(4, 5-dimethyl-2-thiazolyl)-2, 5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide (MTT). The optical density difference (OD) was detected by enzymelinked immunosorbent assay. The apoptosis of Hela cells was detected by TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling (TUNEL), and calculating the percentage of apoptosis.ResultsProliferation of Hela cells was inhibited by AZD1152 (P＜ 0.05). And the effect of inhibition was enhanced with the concentration of AZD1152 and days of cell culture. There was signi fi cant difference between experimental group and control group (P＜ 0.05). Apoptosis of Hela cells was enhanced by AZD1152 (P＜ 0.05). And the effect of potentialization was changed with the concentration of AZD1152 and days of cell culture. There was significant difference between experimental group and control group (P＜ 0.05).ConclusionAZD1152, the speci fi c inhibitor of Aurora-B, can inhibit the cervical cancer Hela cells proliferation.

R738．1

A

1674-9316（2017）09-0121-04

10．3969/j．issn．1674-9316．2017．09．070

廣東省深圳市南山區資助科技計劃區屬事業單位研發項目（2015055）

廣東省深圳市南山區西麗人民醫院婦產科，廣東 深圳518055