低氧誘導因子-1α介導鼠胚成骨細胞凋亡的實驗探討

施華麗

(浙江醫學高等專科學校， 浙江 杭州 310053)

低氧誘導因子-1α介導鼠胚成骨細胞凋亡的實驗探討

施華麗

(浙江醫學高等專科學校， 浙江 杭州 310053)

目的探討低氧誘導因子-1α參與介導的鼠胚成骨細胞凋亡實驗特點。方法由本文作者與某醫科大學中心實驗室合成完成鼠胚成骨細胞原代培養、鑒定；行成骨細胞低氧狀態下培養。結果經氯化鈷處理后，低氧組Caspase-3mRNA和HIF-1α的表達呈漸趨增加表現，具統計差異(P＜0.05)，經觀察，除第0d外，均較常氧組高(P＜0.05)，而各時間段常氧組變化不明顯(P＞0.05)。Bcl-2mRNA表達呈下降顯示，除0d外，均較常氧組低(P＜0.05)，各時間段常氧組變化無差異(P＞0.05)。結論氯化鈷可對低氧狀態化學模擬，使成骨細胞有大量的HIF-1α表達，其可通過對Bcl-2和Caspase-3的表達調節，對成骨細胞凋亡加以促進，且此種促進作用與細胞缺氧的時間具密切相關性。

低氧誘導因子-1α；鼠胚成骨細胞；凋亡試驗

骨折愈合有眾多細胞參與，機制較為復雜，所處的愈合階段不同，參與的細胞也存在較大差異，但以一些骨系細胞為主，如破骨細胞、成骨細胞等。骨折發生后，創傷處呈低氧狀態，在骨折愈合過程中，低氧誘導因子-1α起著重要的調控作用[1]。本次研究從細胞凋亡角度展開探討，了解在氯化鈷誘導的化學模擬低氧條件下，對鼠胚成骨細胞凋亡情況進行研究，探討其凋亡途徑，現回顧結果如下。

1 資料與方法

1.1 實驗動物和儀器、試劑

由Gibco公司對高糖DMEM培養基提供，由大連寶生物公司對DL2000DNA Marker提供，實驗動物及其余試劑由某醫科大學動物中心及PCR實驗室提供。

1.2 方法

(1)由本文作者與某醫科大學中心實驗室合成完成鼠胚成骨細胞原代培養、鑒定；(2)成骨細胞低氧狀態下培養：取第3代傳代培養的細胞，培養液為含125umol/L終濃度氯化鈷的DMEM，行不同時間的培養，對缺氧情況化學模擬；(3)依據RNA提取盒相關操作步驟，對總RNA提取，行OD260、OD280吸光值測定，對RNA提取結果檢測。(4)從GeneBank中查找 GAPDH等序列，對引物設計。利用TaKaRa一步法檢測半定量RT-PCR；(3)測定PCR：取PCR產物5微摩爾，實施2%瓊脂糖凝膠電泳操作，在紫外燈下實施細致觀察，經凝膠掃描系統實施光密度計分掃描，計算HIF-1a等與CAPDH光密度積分比值，并完成相關定量分析。(4)抽取蛋白質及分析Western blot：對呈對數生長期的相關細胞收獲，用三去污裂解液重懸細胞，并行3～5 min反復吹打，完成混勻操作后，于4度條件下，行溫育20 min操作，在12000轉離心操作20 min，將上清取出，作為細胞總蛋白質，在-70度分裝儲存。取蛋白質樣品50～100 μg與等體積上樣緩沖液混合，變性5 min，于8%或12%聚丙烯酰胺凝膠樣品孔中加載，以恒壓60 v電泳至溴酚藍達凝膠底邊，將凝膠取出，用電轉儀行轉移1～3 h操作，室溫封閉8%脫脂奶粉2 h，分別取Caspase-3多克隆抗體、人兔抗鼠Bcl-2于4度條件下溫育過液，后取酶標記的山羊抗兔IgG室溫溫育2 h，ECL顯色，對結果觀察。

1.3 統計學分析

采用spss13.0統計學軟件，計數資料行χ2檢驗，P＜0.05具統計學差異。

2 結果

經氯化鈷處理后，低氧組Caspase-3mRNA和HIF-1α的表達呈漸趨增加表現，具統計差異(P＜0.05)，經觀察，除第0 d外，均較常氧組高(P＜0.05)，而各時間段常氧組變化不明顯(P＞0.05)。Bcl-2mRNA表達呈下降顯示，除0d外，均較常氧組低(P＜0.05)，各時間段常氧組變化無差異(P＞0.05)。見表1。

表1 各時間段RT-PCR測得的相關指標表達

3 討論

骨折愈合病理生理過程均較復雜，骨折發生時，常造成程度不等的骨折端及附近血管、骨膜受損，促使骨折端局部呈缺氧、缺血狀況，心氧分壓在創傷中可呈0～2%降低[2]。后機體經各種機制，可促使骨折部位發生再血管化，使此部位血供漸趨提高，正常的氧分壓得以恢復。機體需再血管化的時間通常約1～2周。但創傷發生后，在氧濃度下降時，復雜的骨再生過程即已開始。在缺氧過程中，機體會有一種由低氧信號參與調控的轉錄因子-HIF-1α表達。多項研究已證實，HIF-1α在骨折愈合過程中，可通過對VEGF的表達誘導，對骨折處血管生成加以促進，進而加快骨折愈合進程[3]。此外，在骨折愈合早期，在成骨細胞凋亡進程中，HIF-1α可能發揮中樞紐帶價值。

細胞凋亡主要經2種途徑，屬細胞自身程序性死亡，一種是死亡依賴途徑，由 Caspase家族的分子參與，以Caspase-3最為常見；另一種為線粒體依賴途徑，由Bcl-2分子參與。Caspase-3屬對凋亡有促進作用分子，而Bcl-2屬對凋亡抑制的分子。據相關研究示，依據細胞類型差異，HIF-1α對細胞凋亡除有促進作用產生外，也有抑制作用產生[4-5]。如HIF-1α可經結合ARNT形成二聚體，進而對多數腫瘤細胞凋亡抑制，在腫瘤侵襲過程中發揮促進作用；相反，HIF-1α對神經元細胞、椎間盤細胞的凋亡具一定的促進作用。本次研究結果也證實，相較常氧組，低氧環境下的成骨細胞有較高的發生凋亡的比例，故低氧環境對成骨細胞的凋亡有促進作用。

綜上，氯化鈷可對低氧狀態化學模擬，使成骨細胞有大量的HIF-1α表達，其可通過對Bcl-2和Caspase-3的表達調節，對成骨細胞凋亡加以促進，且此種促進作用與細胞缺氧的時間具密切相關性。

[1] Paveenarat Aukkarasongsup，Naoto Haruyama，Tsutomu Matsumoto，et al.Periostin inhibits hypoxia-induced apoptosis in human periodontal ligament cells via TGF-β signaling[J].BBRC，2013，441 (1)：126-132.

[2] 周 年，黃 偉，廖軍義，等.低氧誘導因子-1α對骨形態發生蛋白2誘導的干細胞成軟骨、成骨分化的影響[J].第三軍醫大學學報，2014/12.

[3] 趙煥新，李曉宇，姚 紅，等.低氧后處理誘導的低氧誘導因子-1α表達上調減輕H9c2心肌細胞低氧/復氧損傷[J].生理學報，2013/03.

[4] 潘星辰，周韶璋，戴 輝，等.低氧誘導因子-1α mRNA在克唑替尼誘導H2228細胞凋亡中的作用[J].廣東醫學，2014/13.

[5] 景紹武，趙志軍，景尚華，等.低氧誘導因子-1α與鼻咽癌臨床病理特征相關性Meta分析[J].中華腫瘤防治雜志，2015/07.

浙江省醫藥衛生科技項目項目編號：2014KYA049。

本文編輯：彭晚林

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ISSN.2095-8242.2017.12.2373.02