二甲雙胍抗腫瘤血管及抑制胃癌細胞生長的實驗研究

徐晨，胡家平，李太原

（南昌大學第一附屬醫院普外科，江西南昌330006）

二甲雙胍抗腫瘤血管及抑制胃癌細胞生長的實驗研究

徐晨，胡家平，李太原

（南昌大學第一附屬醫院普外科，江西南昌330006）

目的探討二甲雙胍抗腫瘤血管及抑制胃癌細胞生長的實驗研究。方法應用Traswel l侵襲試驗以及Matr igel血管狀結構形成實驗研究二甲雙胍對于血管內皮細胞的侵襲以及血管狀結構形成的作用；應用胃癌細胞BGC823MTT試驗和Annexin-V細胞凋亡試驗明確二甲雙胍在抑制為癌細胞生長方面的影響。結果二甲雙胍可顯著抑制腫瘤血管的侵襲以及血管狀結構的形成，并能抑制胃癌細胞BGC823的增殖，誘導其凋亡，其中10 mmol/L二甲雙胍的凋亡率高達60%。結論二甲雙胍具有抗腫瘤血管及抑制胃癌細胞生長作用，并能促使胃癌細胞凋亡，發揮其抗腫瘤作用。

二甲雙胍；抗腫瘤血管；抑制胃癌細胞生長

二甲雙胍，屬于雙胍類降血糖藥物，可減少患者肝臟糖異生，并促使肌肉組織與脂肪攝取葡萄糖，實現降血糖目標[1]。而近幾年來，已經有大量臨床實驗證明二甲雙胍不但是良好的降血糖藥物，還可抑制肺癌、肝癌、腎癌以及乳腺癌生長。同時，亦有文獻證實二甲雙胍可誘導腫瘤細胞凋亡[2]。本研究為明確二甲雙胍抗腫瘤血管及抑制胃癌細胞生長作用，通過各項試驗予以研究，現將試驗結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑選取北京協和細胞庫提供的胃癌細胞BGC823，Singma公司提供的二甲雙胍、結晶紫染液和MTT，Mi l lipore公司提供的Transwel l小室，Mbchem公司提供的AV/PI雙染凋亡檢測試劑盒以及BD公司提供的Matr igel膠，美國ScienCel l公司提供的ECM培養基和HUVEC。

1.2 試驗方法

1.2.1 胃癌細胞Traswel l侵襲試驗制作人臍靜脈血管內皮細胞（HUVEC）懸液，將細胞濃度控制在2.5×105個/mL，取100μL細胞懸液置入Transwel l上層小室內，并將ECM培養基600 L置入下層。細胞固定好后，將5 mmol/L、10 mmol/ L二甲雙胍培養基100μL置入，并設定空白對照組。培養細胞1 d后取出小室，使用PBS進行徹底清洗，再應用4%的多聚甲醛進行20 min固定處理，再使用結晶紫染液進行10 min的染色，擦拭干凈上室中細胞，在顯微鏡下進行圖像采集，評估二甲雙胍對于血管內皮細胞的侵襲。

1.2.2 Mat rigel血管狀結構形成實驗把Mat rigel基質膠置放于4℃環境下進行解凍，并均勻鋪散在96孔的細胞培養板中。將培養板放在37℃的培養箱內孵育0.5 h，使用濃度為2×105個/mL的HUVEC懸浮細胞加入培養板，每個孔均為100μL。細胞固定好后，將5 mmol/L、10 mmol/L二甲雙胍培養基100μL置入，并設定空白對照組。繼續在孵育箱內培養，12 h后在顯微鏡下觀察其微管形成狀況。

1.2.3 胃癌細胞BGC823MTT試驗對胃癌細胞BGC823進行離心處理，除去培養基后使用新鮮的培養基予以重懸，使用5×103個/孔與96孔板進行接種。培養1 d后分別置入0 mmol/L、5.0 mmol/L、20.0 mmol/L、60.0 mmol/L二甲雙胍，在37℃環境下培養3d后去除培養基，在每個孔中置入20μL含有5 mg/mL的MTT無血清培養基，在37℃環境下完成4 h的孵育，離心15 min后取出上清，置入200μL的DMSO，振蕩10 min后使用酶標儀檢查其波長，測定OD值。

1.2.4 Annexin-V細胞凋亡試驗將胃癌細胞BGC823分別在5 mmol/L、10 mmol/L二甲雙胍內暴露1d后，給予離心處理并除去培養基，再使用PBS清洗2次，置入Annexin-V2μL和Binding Buf fer100μL，避光0.5 h后加入PI4μL，反應5 min后置入Binding Buf fer400μL。使用流式細胞儀檢查其細胞凋亡狀況。

2 結果

2.1 二甲雙胍對于HUVEC細胞侵襲影響相較于空白對照組，5 mmol/L、10 mmol/L二甲雙胍均可抑制HUVEC細胞侵襲能力。見圖1。

圖1 二甲雙胍抑制HUVEC細胞侵蝕的作用

2.2 二甲雙胍對于HUVEC細胞血管狀結構形成的作用因為HUVEC細胞可于體外Matrigel形成血管狀結構，并模擬正常人體中毛細血管的生成過程。因而本研究通過觀察HUVEC細胞于Mat rigel膠中形成的血管樣結構評估二甲雙胍對于血管形成的作用。結果顯示，5 mmol/L、10 mmol/L二甲雙胍均可抑制內皮細胞形成血管狀結構。見圖2。

圖2 二甲雙胍對于HUVEC細胞血管狀結構形成的作用

2.3 二甲雙胍抑制胃癌BGC823細胞增殖的作用應用MTT試驗檢測各組細胞OD值，公式如下：抑制率=對照組OD值與給藥組OD值差值/對照組OD值×100%，計算各組濃度抑制率：0 mmol/L二甲雙胍（空白對照組）=0；5.0 mmol/L二甲雙胍=13.15%；20.0 mmol/L二甲雙胍=48.93%；60.0 mmol/L二甲雙胍=68.84%。

2.4 二甲雙胍促胃癌BGC823細胞凋亡的作用經Annexin-V/PI實驗結果顯示，二甲雙胍能夠促使胃癌BGC823細胞凋亡，并具有濃度依賴性，其中10 mmol/L二甲雙胍組的凋亡比例大約為60.0%。

3 討論

二甲雙胍具備抗腫瘤多樣生物活性，據臨床研究已經證實，二甲雙胍能夠抑制結腸癌、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、神經膠質瘤和腎癌等惡性腫瘤生長，然而在抑制胃癌生長方面的作用機制尚未明確[3]。經臨床試驗發現，二甲雙胍對腫瘤血管新生有抑制作用[4]，因而本研究使用HUVEC研究二甲雙胍對于腫瘤血管侵襲的干預作用。結果顯示，二甲雙胍可顯著抑制HUVEC侵襲。因為Mat r igel血管狀結構形成試驗可模擬正常人體中腫瘤血管生成過程，因而本研究搭建HUVEC血管狀結構的形成模型，結果顯示二甲雙胍能夠抑制HUVEC血管樣結構形成，印證了二甲雙胍對于腫瘤血管形成的抑制作用。

另外，既往研究結果顯示，二甲雙胍對于腫瘤細胞有直接作用，能夠抑制其增殖，并誘導其凋亡，最終實現對腫瘤細胞生長的抑制作用[5]。比如，有學者經研究證實二甲雙胍可激活腫瘤細胞中AMPK，發揮對乳腺癌增殖的抑制性作用，也可誘導卵巢癌細胞的凋亡。同時，還有研究人員表示二甲雙胍能夠抑制結腸癌細胞表達，增加Bax表達，發揮其促癌細胞凋亡的作用[6]。然而，對于胃癌研究尚未明確，所以本組研究通過MTT實驗發現，二甲雙胍對對于胃癌BGC823細胞增殖有抑制作用，最大抑制率約60%。而nnexin-V/PI流式凋亡檢驗結果顯示，二甲雙胍可促使胃癌BGC823細胞凋亡。

綜上所述，作為糖尿病一線藥物的二甲雙胍對于腫瘤多類生物活性，已經備受研究者關注。據本組研究結果可知，二甲雙胍對于腫瘤血管形成具有較強的抑制性作用，同時還可直接作用在胃癌細胞上，在抑制其增殖的同時誘導其凋亡，從而發揮其胃癌的積極作用。

參考文獻

[1]魏德強，王冰，王烈.二甲雙胍對胃癌細胞株增生及Cycl in D1表達的影響[J].國際外科學雜志，2010，37（3）：171-174.

[2]薛知新，鐘捷，趙丹瑜，等.二甲雙胍對AGS胃癌細胞生長侵襲的抑制作用[J].世界華人消化雜，2010，18（19）：1974-1978.

[3]薛知新，趙丹瑜，許慈，等.二甲雙胍對人胃癌細胞株MKN45增殖和遷徙的影響[J].胃腸病學，2010，15（5）：280-283.

[4]謝穎，賴曉陽.二甲雙胍及甘精胰島素對子宮內膜癌細胞增殖和凋亡的影響[J].中國糖尿病雜志，2014，22（6）：556-559.

[5]李鵬，劉江偉，韓振魁，等.二甲雙胍對人胰腺癌細胞增殖與凋亡的影響及其分子機制的研究[J].中華肝膽外科雜志，2012，18（12）：933-937.

[6]賀志龍，夏偉，馮璜，等.二甲雙胍對人胰腺癌細胞株CFPAC-1增殖與凋亡的影響[J].中華胰腺病雜志，2014，14（3）：181-184.

10.3969/j.issn.1009-4393.2017.05.054