探討食品檢驗中乳酸菌的鑒定方法

據《食品安全國家標準食品微生物學檢驗乳酸菌檢驗》標準所示，乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）主要有乳桿菌、鏈球菌以及雙歧桿菌三種菌屬，并在食品、藥品中廣泛存在。為響應國家對食品安全的監管，本文特從不同角度鑒定食品中的乳酸菌菌種水平，詳細研究過程如下：

資料與方法

一般資料。本次研究所有菌種均采自某市微生物菌種保藏中心，共計15株。其中乳酸桿菌6株，雙歧桿菌7株，鏈球菌2株。

鑒定儀器：（1）API鑒定系統、API 50 CHL板條、API 20A 板條（生產廠家：法國生物梅里埃公司）；（2）RP耗材樣品制備包（生產廠家：美國杜邦公司）；（3）生化管（生產廠家：杭州濱和微生物）；（4）Riboprinter全自動微生物基因指紋鑒定系統（生產廠家：美國Dupont公司）；（5）Quantity One紫外成像儀、電泳儀（生產廠家：美國BioRad公司）；（6）Veritii PCR擴增儀（生產廠家：美國ABI公司），體積為50μL[2]。

鑒定試劑：（1）細菌基因組DNA提取試劑盒（生產廠家：北京天根生物）；（2）DNA Marker、PCR緩沖體系（緩沖液5μL，含MgCl2）以及rTaqDNA聚合酶（生產廠家：大連寶生物工程有限公司）0.25μL；（3）正向引物27F（5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3）、反向引物1492R（5-TACGGCTACCTGTTACTT-3）各200pmol/L。

鑒定方法。染色鏡檢：根據《食品安全國家標準食品微生物學檢驗乳酸菌檢驗》中乳酸菌的生化反應指標，篩選單菌落革蘭染色鏡檢。根據《食品安全國家標準食品微生物學檢驗雙歧桿菌的鑒定》檢驗雙歧桿菌。

API鑒定：乳酸桿菌由API 50 CHL板條進行鑒定，雙歧桿菌由API 20A 板條進行鑒定。

分析法鑒定：（1）16S rRNA基因序列分析法鑒定：由DNA提取試劑盒提取單菌落細菌基因組DNA，100℃熱蓋，95℃持續變性1min，56℃退火30s，72℃延伸90s，PCR循環共30個；72℃延伸10min；采用1.5%瓊脂糖凝膠電泳PCR產物，利用紫外凝膠成像分析儀觀察電泳結果，然后通過Clustalw軟件對測序結果加以分析，并通過GenBank數據庫行BLAST對比。（2）RiboPrinter指紋圖譜分析法鑒定：將單菌落懸浮于緩沖液內，并作95℃處理，隨即加入裂解液A、B 5μL，然后采用Riboprinter全自動微生物基因指紋鑒定系統進行鑒定。

結果

染色鏡檢。鑒定結果顯示，1株乳酸桿菌和1株鏈球菌的生化反應不符合《食品安全國家標準食品微生物學檢驗乳酸菌檢驗》標準，但5株乳酸桿菌和1株鏈球菌的生化反應符合標準。6株雙歧桿菌的生化反應不符合標準，僅1例完全符合。如圖所示，所有菌株均為革蘭陽性菌，無芽孢。

API鑒定。4株乳桿菌鑒定結果顯示“類干酪乳桿菌干酪亞種”，未達到“種”水平。2株雙歧桿菌鑒定結果顯示“內放線菌”，未達到“屬”水平；4株雙歧桿菌鑒定結果顯示“雙歧桿菌1”，未達到“種”水平。2株乳桿菌、2株鏈球菌以及1株雙歧桿菌鑒定結果均達到“種”水平。

分析法鑒定。16S rRNA基因序列分析法鑒定：15株中12株鑒定結果達到“種”或“亞種”水平，但3例未達到。RiboPrinter指紋圖譜分析法鑒定：15株中11株鑒定結果達到“種”或“亞種”水平，3例未達到，1例未能鑒定。

討論

《食品安全國家標準食品微生物學檢驗乳酸菌檢驗》指出，菌株不同，其生理生化特征存在明顯差異，因此本文結果顯示6株雙歧桿菌的生化反應不符合標準，且API鑒定結果顯示15株中10株僅達到“屬”水平。

而分析法鑒定結果相對理想，比如16S rRNA基因序列分析法和RiboPrinter指紋圖譜分析法通過PCR對DNA片段加以選擇，不受培養條件限制，其鑒定結果如本文所示：15株中11株鑒定結果達到“種”或“亞種”水平。綜合以上三種鑒定方法可知，參照《食品安全國家標準食品微生物學檢驗乳酸菌檢驗》與《食品安全國家標準食品微生物學檢驗雙歧桿菌的鑒定》的染色鏡檢雖具有一定乳桿菌、鏈球菌的鑒定能力，但雙歧桿菌的鑒定水平不足；而API對三種菌屬的鑒定能力基本一致，但整體水平相對較弱，無法達到“種”水平；相較以上兩種方法，分析法鑒定既符合國家標準，同時又對API鑒定進行了有效補充。

綜上所述，在食品檢驗中，分析法鑒定水平最高，為食品安全提供有力保障，值得大力推廣。