運用高效液相色譜測定葡萄酒中的添加劑

在科學技術快速發展的背景下，許多新的檢測技術和檢測方法被廣泛應用在食品安全檢測中，有利于從技術層面保障食品的健康。當前有不同類型的檢測方法可以分別測定葡萄酒中的甜味劑、色素、防腐劑等，但是這些方法需要花費較長的檢測時間，檢測程序相對繁雜，不能同時快速測定葡萄酒中不同類型的添加劑。高效液相色譜作為一種全新的檢測方法，將其應用于葡萄酒的測定中，可以很好地檢測出酒中的添加劑，達到良好的測定效果。

高效液相色譜法概述

對于高效液相色譜法而言，其也稱之為近代柱色譜、高分離度液相色譜、高速液相色譜、高壓液相色譜等，可分為親和色譜、離子色譜、吸附色譜、體積排阻色譜、分配色譜等類型，指的是在分析化學和生化中經常采用的柱層析儀。作為色譜法中的重要內容，高效液相色譜是以液體為流動相，借助高壓輸液系統，在裝有固定相的色譜柱中泵入不同比例的緩沖液、混合溶劑或不同極性的單一溶劑，當柱內的成分進行分離后加以檢測，有效分析試樣。該方法可以及時準確解決不同學科領域中的數據問題，如法檢、商檢、工業、化學、農業、醫學等，逐漸成為重要的分離分析技術。

材料與方法

儀器設備和材料、試劑。本實驗中采用的儀器設備主要是沃特世高效液相色譜儀ACQUITY UPLC H-Class Bio、二極管陣列檢測器、自動進樣器。而實驗中使用的10份葡萄酒樣品規格為750mL，試劑為0.5mg/mL的赤蘚紅、胭脂紅、檸檬黃、莧菜紅、日落黃與1.00mg/mL的誘惑紅，純度為99.5%的對羥基苯甲酸丁酯、對羥基苯甲酸丙酯、對羥基苯甲酸甲酯、苯甲酸，純度為99.9%的糖精鈉、對羥基苯甲酸乙酯，純度為91%的靛藍與純度為99%的山梨酸和安賽蜜，純度為92%的新紅。

儀器條件和樣品處理。

（1）儀器條件。首先是色譜條件。本實驗選用的色譜柱為ACQUITY UPLC 1.7μm，柱溫為30℃，流速是1.0mL/min，而進樣量為10μL，流動相為20mmol/L 乙酸銨-甲醇，檢測波長涉及630nm的亮藍、425nm的檸檬黃、515nm的誘惑紅、日落黃、胭脂紅、莧菜紅等，下表1表示的是洗脫梯度。其次是質譜條件。對源溫度進行加熱，使其達到300℃，毛細管的溫度達到350℃，噴霧電壓處于負離子的模式，電壓為3000V，質量掃描范圍m/z100～1000，一級質譜全掃描分辨率35000，C-trap的最大等待時間和最大容量（AGC）分別是200ms和3×106。

（2）樣品處理。在實驗過程中，將5mL的樣品吸入到10mL的比色管中，利用蒸餾水進行定容，使其達到規定的刻度，在基礎上進行混合搖勻，然后經過0.45μm的無機濾膜，上機進樣10μL進行色譜分析。

（3）方法。以標準物質的峰掃光譜純度和保留時間為依據，按照兩種方式來準確定性樣品峰，借助外標法的方式定量計算峰面積，然后依次分析不同濃度的10種添加劑混合標準溶液，如誘惑紅、胭脂紅、檸檬黃、糖精鈉、山梨酸、日落黃、安賽蜜、莧菜紅、苯甲酸等。值得注意的是，在繪制標準曲線的過程中，縱坐標表示的是峰面積，橫坐標表示的是質量濃度（mg/L）。

結果分析

高效液相色譜條件的優化。誘惑紅、胭脂紅、檸檬黃、糖精鈉、山梨酸、日落黃、安賽蜜、莧菜紅、苯甲酸等10種添加劑在極性方面存在很大的差異，如果僅僅只使用一種色譜體系，則不能達到理想的分離結果。在本次實驗中采用高效液相色譜法，流動相為20mmol/L的乙酸銨-甲醇，借助梯度洗脫的方法來促進分離結果的提高。通常在開始測試時，流動相中的20mmol/L的乙酸銨以及甲醇的比例為95：5，然后在0～15min內調整兩者的比例，使其變為35：65，在15～25min內將兩者的比例調整為2：98，而在25～35min內將兩者的比例調整為95：5.通過這樣的步驟，能夠很好地分離出葡萄酒中的10種添加劑。

利用紫外光譜儀器掃描葡萄酒中的胭脂紅、糖精鈉、誘惑紅、日落黃等10中添加劑標準溶液，然后確定檢測波長，可以得出如下結果：亮藍630nm；檸檬黃425nm；誘惑紅、胭脂紅、莧菜紅、日落黃515nm；山梨酸、安賽蜜、糖精鈉、苯甲酸230nm。按照上述優化后的色譜條件來檢測葡萄酒中10種添加劑混合標準溶液，可以完全分離這些添加劑，形成良好的峰形。

方法檢測限和曲線線性范圍。分別進樣10μL的逐級稀釋的標準工作液，對線性回歸的結果進行測定，其中線性范圍為0.5～20mg/L，下表2為檢測限和回歸方程[x為濃度，（mg/L）；y為峰面積，Counts]相關系數。

精密度與回收率。該實驗中對已知含量的6份同一樣品進行稱取，以供試品制備的方法為依據進行處理，然后通過測定得出結果。可知：樣品中的平均相對標準偏差為0.48%～4.33%（n=6），加標回收率90.0%～108.5%。

方法運用。采用高效液相色譜的方法來測定葡萄酒中的10種添加劑，結合添加劑的光譜圖與保留時間進行定性定量分析，其中3個樣品中可以檢測出山梨酸，如下表3所示。

在上述實驗過程中，構建葡萄酒中日落黃、檸檬黃、山梨酸、安賽蜜、誘惑紅、胭脂紅、糖精鈉、莧菜紅、苯甲酸等10種添加劑的檢測方法，即高效液相色譜法，分別對梯度洗脫條件和流動相進行優化實驗，以便獲得10種添加劑的有效分離。這種方法可以簡單預處理樣品，具備較高的分離度和較廣的線性范圍，精密度與回收率良好，加標回收率保持在90～108.5%的范圍內，測定低限位1.0mg/kg，平均相對標準偏差為0.48%～4.33%，與國內先進水平相符，有利于同時測定葡萄酒中的多種添加劑，達到良好的分離效果。