HPLC法測定纖維低聚糖的研究

宋維春,裴志勝,孫宏元,梁志鵬,李欣怡,徐云升

(海南熱帶海洋學院 生命科學與生態學院,海南 三亞572022)

HPLC法測定纖維低聚糖的研究

宋維春,裴志勝,孫宏元,梁志鵬,李欣怡,徐云升

(海南熱帶海洋學院 生命科學與生態學院,海南 三亞572022)

本研究運用HPLC法,采用Inertsil NH2柱、示差折光檢測器,以乙腈-水為流動相,探索纖維二糖、纖維三糖、纖維四糖、纖維五糖的檢測條件.實驗結果表明:在檢測器靈敏度為+8,流速為1 ml/min,進樣量為10 μL條件下,適宜檢測條件是:流動相為乙腈:水(v/v)=65:35,色譜柱溫度為41℃.在該檢測條件下,峰高Y與濃度X的定量檢測方程為:纖維二糖Y=3001X-147.6;纖維三糖Y=915.9X+411.6;纖維四糖Y=1328X+10002;纖維五糖Y=2029X-1357.

HPLC法;纖維二糖;纖維三糖;纖維四糖;纖維五糖

低聚糖能選擇性地促進腸道內雙歧桿菌和乳桿菌的增殖,體外實驗研究發現Bacteroides等多種腸道共生細菌也能利用低聚糖[1].纖維低聚糖是一種功能性低聚糖,有廣泛的開發應用前景,但因其不穩定、易分解,目前國內對其檢測研究報道甚少.張南南[2]用凝膠色譜法分離純化纖維三糖-纖維六糖、并用電噴霧電離質譜進行了分析檢定.

HPLC法在低聚果糖的檢測中有很多應用[3-4],與其它方法相比是一種高效簡便無損害的分析方法[5],本研究采用Inertsil NH2柱、示差折光檢測器,以乙腈-水為流動相,探索纖維二糖、纖維三糖、纖維四糖、纖維五糖的檢測條件,為纖維低聚糖的制備提供檢測依據.

1 材料與方法

1.1 儀器及條件

LC-2010AHT高效液相色譜儀(島津公司);

RD-20型示差折光顯示器(島津公司);

色譜柱:Inertsil NH2柱、4.6×250 mm,5 μm；

檢測器靈敏度:+8,流速:1 ml/min,進樣量:10 μl.

1.2 試劑

纖維二糖(99%)(Elicityl-OligoTech公司);纖維三糖(95%)(Megazyme公司);纖維四糖(95%)(Megazyme公司);纖維五糖(95%)(Megazyme公司).

1.3 標準溶液配制

精確稱取標準品,置于1 ml容量瓶中,用移液槍移取1000 μl的蒸餾水,振蕩均勻,配成高濃度標準溶液;用移液槍移取300-700 μl高濃度標準溶液,再移入700-300 μl蒸餾水,配成1000 μl低濃度標準溶液.

1.4 進樣處理

用5 ml的注射器吸取待測液,過0.45 μm濾膜并注射到2 ml進樣瓶中進行檢測.

2 結果與分析

2.1 柱溫的確定

在流動相為乙腈:水=65:35條件下,分別采用柱溫38℃、41℃、44℃、47℃,分別測定纖維二糖、纖維三糖、纖維四糖、纖維五糖標準溶液,實驗結果如表1.

表1 柱溫變化對譜峰的影響

注:↑為正常峰;-為未檢出或有倒峰;空白為未實驗

可見,在柱溫為41℃和44℃時,纖維二-五糖均有正常譜峰出現,另從不同柱溫時的保留時間比較可知,柱溫越高,保留時間越短,組分之間的峰距變小,另外,纖維低聚糖在溫度較高時容易分解,故選擇41℃柱溫進行實驗.

2.2 流動相的確定

采用柱溫41℃,在流動相(乙腈:水)分別為75:25、70:30、65:35、60:40條件下,分別測定纖維二糖、纖維三糖、纖維四糖、纖維五糖標準溶液,實驗結果如表2.

表2 流動相比例變化對譜峰的影響

注:↑為正常峰;-為未檢出或有倒峰;空白為未實驗

由表2可見,纖維四糖只有在流動相比例為乙腈:水=65∶35條件下,才有正常譜峰出現,故選擇流動相為乙腈:水=65∶35進行實驗.

2.3 精密度實驗

分別配制83.3 mg/ml纖維二糖溶液、100mg/ml纖維三糖溶液、17.9mg/ml纖維四糖溶液、4.9mg/ml纖維五糖標準溶液,每種溶液重復測定6次,實驗結果如表3.

表3 精密度實驗結果

2.4 標準曲線測定

在柱溫41℃、流動相比例為乙腈:水=65∶35條件下,分別測定不同濃度的纖維二糖、纖維三糖、纖維四糖、纖維五糖標準溶液,確定峰高Y與樣品濃度X的關系,實驗結果如表4.

表4 標準曲線測定結果

2.5 標準品混合檢定

將纖維二糖、纖維三糖、纖維四糖、纖維五糖標準溶液及葡萄糖溶液、纖維六糖溶液混合,在柱溫41℃、流動相比例為乙腈:水=65:35條件下進行測定,混合物的色譜圖如圖1.

圖1 纖維二-五糖混合物色譜圖

與單個樣品的譜圖對比可知, 1為纖維二糖、2為纖維三糖、3為纖維四糖、4為纖維五糖.

2.6 樣品檢測

取香蕉莖干制成粉末[6-7],用酶法[8]降解制成含纖維低聚糖的混合物,在柱溫41℃、流動相比例為乙腈:水=65:35條件下,進行色譜測定,實驗結果如圖2.

根據譜峰高度,用標準曲線計算可知,降解液中含纖維二糖31.7 mg/ml、纖維三糖84.1 mg/ml、纖維四糖11.3 mg/ml、纖維五糖8.4 mg/ml.

3 結論

(1)在檢測器靈敏度為+8、以乙腈-水為流動相、流動相流速為1 ml/min條件下,纖維二糖、纖維三糖、纖維四糖、纖維五糖的適宜檢測條件為:流動相乙腈:水(v/v)=65:35,色譜柱溫度為41℃.

(2)在流動相乙腈:水(v/v)=65:35,色譜柱溫度為41℃條件下,峰高Y與濃度X的定量檢測方程為:纖維二糖Y=3001X-147.6;纖維三糖Y=915.9X+411.6;纖維四糖Y=1328X+10002;纖維五糖Y=2029X-1357.

[1]毛丙永.功能性低聚糖對腸道細菌的影響及機制[D].無錫:江南大學,2015.

[2]張南南.功能性低聚糖的分離純化和生理功能的研究[D].南京:南京林業大學,2012.

[3]武媛麗,楊本鵬,蔡文偉,等.利用高效液相色譜法測定轉基因甘蔗中的低聚果糖[J].熱帶生物學報,2011,2(2):101-106.

[4]萬鵬,趙貞,劉春霞,等.高效液相色譜法測定調制乳中低聚果糖的含量[J].乳業科學與技術,2015,38(3):23-25.

[5]張麗君.低聚果糖檢測分析方法對比及優劣性分析[J].食品工業科技,2015,36(23):395-399.

[6]陳多謀,宋維春,徐云升.香蕉莖干粉制備工藝研究[J].瓊州學院學報,2016,23(2):40-43.

[7]袁學軍,王瓊妹,方慧麗,等.靈芝孢子粉沖劑加工工藝的研究[J].瓊州學院學報,2015,22(5):56-60.

[8]徐小雄,雷鳴,邵貴銀,等.吊羅山阿寬蕉根際土壤放線菌的分離與初步鑒定[J].瓊州學院學報,2014,21(5):58-63.

(編校：李由明)

The HPLC Determination of Cello-oligosaccharides

SONG Wei-chun, PEI Zhi-sheng, SUN Hong-yuan, LIANG Zhi-peng，LI Xin-yi, XU Yun-sheng

(School of Life Science and Ecology, Hainan Tropic Ocean University, Sanya Hainan 572022, China)

In this paper, the HPLC-RID determination conditions of cellobiose, cellotriose, cellotetraose and cellopentaose were explored with Inertsil NH2chromatographic column.The results showed that the appropriate HPLC conditions on the determination of cello-oligosaccharides are that the mobile phase is acetonitrile/water (v/v) = 65/35; the velocity of mobile phase, 1ml/min; column temperature, 41℃; and the sensitivity of detector, +8.Correlations of peak height(Y) and concentration(X) are Y=3001X-147.6 for cellobiose, Y=915.9X+411.6 for cellotriose, Y=1328X+10002 for cellotetraose, and Y=2029X-1357 for cellopentaose.

HPLC; cellobiose;cellotriose; cellotetraose;cellopentaose

格式：宋維春,裴志勝,孫宏元,等.HPLC法測定纖維低聚糖的研究[J].海南熱帶海洋學院學報,2017，24(2)：70-73.

2017-02-22

國家自然科學基金項目(21262026)

宋維春(1965-),女,遼寧遼陽人,海南熱帶海洋學院生命科學與生態學院教授,碩士,研究方向為食品化學.

徐云升(1963-),男,遼寧遼陽人,海南熱帶海洋學院生命科學與生態學院教授,碩士,研究方向為食品科學.

O629.1；TS20

A

2096-3122(2017) 02-0070-04

10.13307/j.issn.2096-3122.2017.02.14