糖腎方不同提取工藝治療糖尿病腎病的藥效學(xué)比較研究

張浩軍，趙婷婷，劉 鵬，嚴(yán)美花，趙海玲，孔 勤，張并璇，李 平

（中日友好醫(yī)院 臨床醫(yī)學(xué)研究所；北京市免疫炎性疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100029）

糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）作為糖尿病嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥，已成為我國(guó)慢性腎臟病的首位病因[1]。中醫(yī)藥治療DN特色與優(yōu)勢(shì)明顯，本課題組在繼承名老中醫(yī)經(jīng)驗(yàn)基礎(chǔ)上研制了糖腎方，由黃芪、生地等7味中藥組成，具有益氣養(yǎng)陰，活血化瘀之功效，前期RCT臨床試驗(yàn)和體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均顯示其療效確切[2，3]。為了將其開發(fā)為安全有效、服用方便的中藥新藥，根據(jù)方中藥味成分理化性質(zhì)及藥理活性，分別設(shè)計(jì)了3種提取工藝，利用單側(cè)腎切除合并STZ誘導(dǎo)的DN大鼠模型進(jìn)行藥效學(xué)評(píng)價(jià)，以確定最佳工藝。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

Wistar大鼠 220只，雄性，體重為 180～220g，購(gòu)自中國(guó)軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK-（軍）2012-0004。

1.2 糖腎方提取供試樣品的制備

本方由黃芪、生地、大黃、三七、酒萸肉、鬼箭羽及枳殼7味藥組成，根據(jù)藥味所含成分理化性質(zhì)、成分活性文獻(xiàn)報(bào)道及前期研究基礎(chǔ)，共設(shè)計(jì)以下三個(gè)提取工藝：

工藝1（傳統(tǒng)水提）：稱取處方量藥材，除三七粉碎成細(xì)粉外，其余六味藥加水提取2次，濃縮干燥，與三七粉混合過(guò)篩。

工藝2（醇提加水提）：稱取處方量藥材，酒萸肉、三七用60%乙醇提取2次，減壓濃縮；其余5味藥加水提取2次，濃縮，醇沉過(guò)濾，減壓濃縮，干燥后混合粉碎過(guò)篩。

工藝3（醇提加水提）：稱取處方量藥材，酒萸肉、三七、熟大黃用60%乙醇提取2次，減壓濃縮；其余4味藥加水提取2次，濃縮，醇沉過(guò)濾，減壓濃縮，干燥后混合粉碎過(guò)篩。

1.3 試劑與藥品

福辛普利鈉片（中美合資上海施貴寶制藥有限公司，10mg/片），鏈脲佐菌素（美國(guó) Sigma-Aldrich公司），大鼠白蛋白測(cè)定試劑盒（美國(guó)Bethyl公司）。

1.4 實(shí)驗(yàn)儀器

代謝籠（蘇州馮氏實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)備有限公司）；倍易血糖儀（美國(guó)強(qiáng)生公司），CD-1600全自動(dòng)生化分析儀（美國(guó)雅培公司），Model 680酶標(biāo)儀（美國(guó)伯樂(lè)公司），BX-51光學(xué)顯微鏡及DP-70圖像采集系統(tǒng)（奧林巴斯公司）

1.5 動(dòng)物造模

雄性Wistar大鼠，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，進(jìn)行基礎(chǔ)狀態(tài)測(cè)定，剔除血糖與尿蛋白異常的動(dòng)物3只。其余大鼠以3ml/kg腹腔注射1%戊巴比妥麻醉，常規(guī)消毒，背部切口1～1.5cm，暴露右腎，剝離腎臟脂肪及腎上腺，結(jié)扎右腎門血管，切除右腎，縫合切口。術(shù)后動(dòng)物恢復(fù)1周后，按40mg/kg腹腔注射1%的鏈脲佐菌素（用0.1mol/L的pH4.5的檸檬酸緩沖液配制），72h后尾尖采血測(cè)血糖，以高于16.7mmol/L為造模成功。

1.6 分組與給藥

造模成功大鼠165只，按血糖水平隨機(jī)分為11組，模型組，工藝1低、中、高劑量組（TSF1-L，TSF1-M，TSF1-H）、工藝2低、中、高劑量組（TSF2-L，TSF2-M，TSF2-H）、工藝 3 低、中、高劑量組（TSF3-L，TSF3-M，TSF3-H）（各工藝低、中、高劑量分別相當(dāng)于糖腎方 2.5，5，10g 生藥/kg·d）和陽(yáng)性藥對(duì)照組（2.0mg/kg·d福辛普利鈉），每組15只。另取15只未造模動(dòng)物進(jìn)行假手術(shù)，僅暴露右腎不做其它處理，1周后腹腔注射檸檬酸緩沖液，作為正常對(duì)照組。正常對(duì)照組和模型組動(dòng)物給予同容積蒸餾水，連續(xù)給藥12周。

1.7 標(biāo)本采集

造模后第0、4、8、12周，大鼠尾尖采血測(cè)血糖，同時(shí)將大鼠轉(zhuǎn)入代謝籠內(nèi)，禁食給水，收集8h尿液。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)水合氯醛麻醉，腹主動(dòng)脈取血，分離血清，并摘取左腎，橫切后取中間部分固定于10%中性甲醛溶液進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。

1.8 指標(biāo)檢測(cè)

一般狀態(tài)：動(dòng)物每周稱體重，密切觀察動(dòng)物精神狀態(tài)，反應(yīng)性，毛發(fā)色澤，飲食及排泄?fàn)顩r。

尿白蛋白：將各時(shí)間點(diǎn)收集的尿液以8000轉(zhuǎn)/分離心10min，吸取上清，按試劑盒說(shuō)明書用ELISA法檢測(cè)尿白蛋白，用自動(dòng)血生化分析儀測(cè)定尿肌酐；計(jì)算尿白蛋白/肌酐比值。

血生化指標(biāo)：用強(qiáng)生OneTouch Ultra II穩(wěn)豪血糖儀測(cè)定各時(shí)間點(diǎn)血糖值，血清樣本用全自動(dòng)血生化分析儀測(cè)定血清總蛋白（total protein，TP）、白蛋白（albumin，ALB）、尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）、 肌酐（creatinine，Cre）、 谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、 谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate transaminase，AST）、總膽固醇（total cholesterol，T-CHO）、甘油三酯（triglyceride，TG）、高密度脂蛋白膽固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）及低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）。

組織病理學(xué)指標(biāo)：腎組織用10%中性甲醛溶液固定24h后，乙醇脫水，石蠟包埋，切片厚度3μm，進(jìn)行PAS染色，光鏡下觀察腎組織病理學(xué)變化。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，單變量方差分析（One-Way ANOVA），組間兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)組大鼠一般狀態(tài)及體重變化

從實(shí)驗(yàn)開始，模型大鼠出現(xiàn)飲食飲水量增加，排尿增多，動(dòng)物消瘦，毛色發(fā)黃，精神狀態(tài)變差，實(shí)驗(yàn)期間動(dòng)物死亡9只，其中TSF1-L死亡2只，TSF1-H死亡1只，TSF2-M死亡1只，TSF2-H死亡2只，TSF3-L死亡1只，TSF3-H死亡2只。與正常對(duì)照組比，模型組大鼠體重顯著降低，糖腎方3個(gè)工藝3個(gè)劑量均對(duì)模型大鼠體重?zé)o明顯影響（圖 1）。

2.2 實(shí)驗(yàn)組大鼠血糖變化

造模后，模型組大鼠各個(gè)時(shí)間點(diǎn)血糖水平顯著高于正常對(duì)照組，糖腎方3個(gè)工藝各劑量組血糖水平與模型組大鼠相比無(wú)顯著性差異，表明糖腎方無(wú)明顯的降血糖作用（圖2）。

2.3 實(shí)驗(yàn)組大鼠尿蛋白肌酐比值變化

與正常對(duì)照組比，模型組尿白蛋白肌酐比值顯著升高，TSF1-M和陽(yáng)性對(duì)照藥顯著降低模型大鼠尿白蛋白肌酐比值，其余各給藥組與模型組比，尿白蛋白肌酐比值無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（圖3）。

2.4 實(shí)驗(yàn)組大鼠腎功、TP及ALB變化

與正常對(duì)照組比，模型組大鼠血清BUN和Cre水平顯著升高，TP與ALB水平顯著降低。糖腎方3個(gè)工藝各劑量與陽(yáng)性藥蒙諾對(duì)模型大鼠血清BUN水平無(wú)明顯影響，但顯著降低模型大鼠Cre水平。與模型組比，TSF1-M組血清ALB水平明顯升高，TSF2-M組TP水平顯著升高，其余各給藥組血清TP與ALB水平與模型組無(wú)顯著性差異（表 1）。

2.5 實(shí)驗(yàn)組大鼠血脂及肝功變化

正常對(duì)照組與模型組血清T-CHO、LDL-C和AST水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，TG水平和HDL-C顯著降低，ALT水平顯著升高，與模型組比，TSF1-M，TSF2-L，TSF2-M及TSF3-L組血清HDL水平顯著升高，TSF2-M和TSF3-L血清T-CHO水平顯著升高，TSF1-M血清AST水平顯著升高，糖腎方3個(gè)工藝各劑量和陽(yáng)性對(duì)照藥對(duì)模型大鼠血清TG、LDL-C和AST水平無(wú)顯著影響（表2）。

2.6 實(shí)驗(yàn)組大鼠腎組織病理變化

正常對(duì)照組腎小球結(jié)構(gòu)清晰，未見系膜基質(zhì)增生，腎小管結(jié)構(gòu)正常，排列整齊，模型組腎臟明顯增大，腎小球內(nèi)系膜基質(zhì)中度增生，部分區(qū)域出現(xiàn)局灶性腎小球硬化，腎小管上皮細(xì)胞呈現(xiàn)玻璃滴樣病變和空泡變性，部分區(qū)域出現(xiàn)腎小管擴(kuò)張、萎縮及壞死。間質(zhì)散在淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞浸潤(rùn)及纖維化，TSF1-M組和陽(yáng)性藥對(duì)照組腎小球及小管間質(zhì)病變與模型組比明顯改善，TSF1-L組與TSL1-H組腎小球系膜輕度增生，腎小管部分區(qū)域有擴(kuò)張，個(gè)別區(qū)域有壞死，TSF2-L組、TSF2-M組、TSF2-H組腎組織病變程度在正常對(duì)照組和模型組之間，TSF3-L、TSF3-M、TSF3-H組腎小球系膜基質(zhì)增生程度與模型組相比無(wú)明顯改善，且TSF3-M、TSF3-H組腎小管間質(zhì)損害如炎細(xì)胞浸潤(rùn)、小管擴(kuò)張程度較模型比更為嚴(yán)重（圖4，見封底）

表1 糖腎方不同提取工藝對(duì)腎功、TP和ALB的影響

表2 糖腎方不同提取工藝對(duì)血脂及肝功的影響

3 討論

糖腎方作為本課題組研制的治療DN中藥復(fù)方，多中心RCT臨床試驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的研究中已證實(shí)了其療效[2，3]。然而，在開展了成藥性研究中發(fā)現(xiàn)：采用傳統(tǒng)水提工藝的糖腎方出膏率較高，在制劑和毒理研究中也會(huì)存在服用量大、給藥困難等問(wèn)題。文獻(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)，黃芪、生地、山茱萸中的多糖類成分是本方出膏率高的主要因素，而三七總皂苷和山茱萸的環(huán)烯醚萜總苷改善DN作用明顯[4，5]，大黃中的蒽醌類成分如大黃酸等對(duì)DN具有腎保護(hù)作用[6]，但該類成分也存在肝腎毒性等問(wèn)題[7]，上述成分醇提溶出率高，且可降低出膏率。因此在工藝研究中設(shè)計(jì)了部分藥味醇提的2種工藝，并與水提工藝進(jìn)行藥效比較，以期獲得最佳提取工藝。

DN研究中由于糖尿病引起模型動(dòng)物腎損害較為緩和，且病程較長(zhǎng)，單側(cè)腎切除可加速DN病程及加重腎臟病理改變[8]，是一種較為理想的DN藥效學(xué)評(píng)價(jià)模型。本研究利用單側(cè)腎切合并STZ注射誘導(dǎo)大鼠高血糖12周后，尿白蛋白肌酐比值較正常對(duì)照組升高了約20倍，出現(xiàn)腎小球系膜基質(zhì)增生、腎小管擴(kuò)張、萎縮及間質(zhì)纖維化等病理改變，表明模型建立成功。在此基礎(chǔ)上進(jìn)行了糖腎方不同提取工藝的藥效學(xué)比較。結(jié)果表明工藝1中劑量在降低尿白蛋白排泄和改善腎病理?yè)p傷效果最為顯著，且顯著升高模型大鼠血清HDL-C水平，提示其也有改善脂代謝異常的作用。而高劑量組藥效較差，未顯示量效相關(guān)性。一方面可能由于高劑量糖腎方給藥量過(guò)大，影響了大鼠食欲與狀態(tài)，另一方面其ALT顯著升高，提示高劑量的工藝1可能損傷了肝功能，引起藥物代謝動(dòng)力學(xué)改變，影響藥效發(fā)揮。工藝2對(duì)尿白蛋白和腎損害也表現(xiàn)出改善的趨勢(shì)，但不及工藝1。有報(bào)道黃芪多糖和地黃多糖具有減輕DN的活性[9，10]，黃芪中的皂苷[11]、地黃中的梓醇[12]以及枳殼中的柚皮苷[13]、橙皮苷[14]對(duì)DN也有腎保護(hù)作用，醇沉工藝除去了大部分多糖，也引起上述成分含量降低，可能與其藥效降低有關(guān)。研究還發(fā)現(xiàn)工藝3甚至還有加重腎損傷的趨勢(shì)，這可能與大黃醇提后蒽醌類溶出增加，后者引起腎毒性所致[15]。

綜上所述，采用傳統(tǒng)水提的工藝1，在改善DN模型大鼠腎組織病理?yè)p害、減少尿白蛋白排泄方面藥效顯著優(yōu)于工藝2和工藝3，為最佳提取工藝，因此，下一步研究將以水提工藝為基礎(chǔ)，對(duì)其不同組分進(jìn)行藥效學(xué)評(píng)價(jià)，為將其開發(fā)為藥效成分明確、質(zhì)量可控、安全有效的中藥新藥奠定基礎(chǔ)。

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