不同品種芡實種仁蛋白質亞基組成及氨基酸分析

陳 靜,陳志宏,張 汆,*,柏 鈺,王 梅

(1.滁州職業技術學院食品與環境工程系,安徽滁州 239000; 2.安徽省熱敏性物料加工工程技術研究中心,安徽滁州 239000)

不同品種芡實種仁蛋白質亞基組成及氨基酸分析

陳 靜1,2,陳志宏2,張 汆2,*,柏 鈺2,王 梅2

(1.滁州職業技術學院食品與環境工程系,安徽滁州 239000; 2.安徽省熱敏性物料加工工程技術研究中心,安徽滁州 239000)

本實驗選擇3個不同品種、2種不同成熟度的5個芡實種仁樣品,通過SDS-PAGE法及氨基酸分析儀法對其蛋白質亞基結構和氨基酸組成進行了初步分析。結果表明,刺芡(成熟)種仁蛋白質含量顯著高于蘇芡(成熟)(p≤0.05),且刺芡(成熟)種仁蛋白質中必需氨基酸、甜味和鮮味氨基酸含量也高于蘇芡(成熟),說明刺芡在營養和口感上要優于蘇芡。SDS-PAGE的分析結果顯示,芡種仁總蛋白中分離出約20條譜帶,相對分子質量在16.24～82.04 kDa之間。其中分子量35.9 kDa左右基含量最高,是芡實總蛋白中最主要亞基。芡實蛋白質中的水溶性蛋白含量很少,且不同成熟度樣品間差異很大,蘇芡(嫩)和淮芡(嫩)中均未檢出水溶性蛋白。品種間醇溶性蛋白質亞基組成差異較大,堿溶性蛋白質亞基及分子量分布品種間和成熟度間差異不大。

芡種仁蛋白質,亞基組成,SDS-PAGE,氨基酸分析

芡實(Euryaleferox)別名雞頭米、雞頭蓮等,為睡蓮科植物芡(EuryaleferoxSalisb.)的干燥成熟種仁。芡實在我國分布廣泛,其主產區為江蘇、安徽、湖北、江西和湖南等地[1]。作為一種藥食同源的傳統中藥材,芡實具有補脾止瀉、益腎固精及祛濕止帶等功效,可用于治療腎病和脾臟功能減退等[2-3]。芡實可食部分為干燥成熟種仁,含有豐富的碳水化合物、蛋白質、維生素和礦物質等多種營養成分[4]。研究表明,芡實具有較強的抗氧化[5]、抗疲勞[6]、提高免疫力[7]、降血糖和降血脂[8]等多種生理保健功效。

目前,關于芡實的研究多集中于其多糖及多酚等成分的分離提取及功能性研究[9-10],但對于芡實中蛋白質的研究較少,不同品種間芡實所含蛋白分子結構的差異性、結構與功能性之間的關系等還不清楚。李成良等[11]的研究顯示,芡實所含的氨基酸中含有6種人體必需氨基酸及2種幼兒必需氨基酸。張曉云等[12]采用超聲波輔助堿法提取芡實中的蛋白質,在單因素和正交實驗基礎上獲得了較好的芡實蛋白提取工藝。俞樂等[13]對4個不同產地芡實種仁中蛋白質的差異性進行了研究,發現不同產地芡實種仁的總蛋白質含量沒有顯著差異,但所提取的4種不同蛋白(清蛋白、醇蛋白、谷蛋白和球蛋白)的含量存在顯著性差異,并采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)分析了不同產地芡實蛋白亞基的差異性。陳蓉等[14]對15個產地的芡實進行氨基酸組成與營養價值評價,發現不同產地芡實所含的某些氨基酸含量差異較明顯。

芡實種仁中一般含有約9%～12%的蛋白質[16],蛋白質的營養價值不僅與其含量、氨基酸組成及蛋白質消化產物中的活性肽等有關,還可能與芡實品種以及成熟度有關。而有關不同品種(刺芡、蘇芡、淮芡)、不同成熟度(成熟、嫩)間芡實蛋白結構方面的差異性,文獻報道不多。

文中通過對芡實中蛋白質亞基組成和蛋白質種類進行分析,擬探尋不同品種、不同成熟度芡實蛋白結構間的差異性。文中選用3個不同品種、2種成熟度的5個芡實種仁樣品,對其中的水溶性蛋白、醇溶性蛋白和堿溶性蛋白組分的亞基組成和氨基酸進行分析,以期為芡實品種鑒別提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

5個芡實種仁樣品:刺芡(成熟),蘇芡(成熟),刺芡(嫩),蘇芡(嫩),淮芡(嫩),其中,刺芡屬于北芡,蘇芡和淮芡屬于南芡 均采自安徽省境內芡實種植基地;氫氧化鈉、甲醇、乙酸、無水碳酸鈉、鹽酸和硫酸鉀等 均為分析純,天津市科密歐化學試劑有限公司;四甲基乙二胺(TEMED)、溴酚藍、十二烷基硫酸鈉(SDS,電泳級)、濃硫酸、硫酸銅和丙三醇等 均為分析,純國藥集團化學試劑有限公司;考馬斯亮藍R250、二硫代蘇糖醇(DTT) 購自上海金穗生物科技有限公司;瓊脂粉(生化試劑級) 購自上海宇涵生物科技有限公司;甲叉雙丙烯酰胺、過硫酸銨、丙烯酰胺 均為電泳級,阿拉丁試劑(上海)有限公司;三羥甲基氨基甲烷(Tris base,電泳級) 購自北京拜爾迪生物技術有限公司;甘氨酸(Gly,分子生化級) 上海拜力生物科技有限公司;低分子量標準蛋白質Marker(14.4～97.4 kDa) 購自中國科學院上海生物細胞研究所。

L550臺式低速離心機 湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司;FD-4型冷凍干燥機 北京博醫康實驗儀器有限公司;DYCZ-24DN型電泳儀 北京市六一儀器廠;L8900型氨基酸分析儀 日本日立公司;YC-820型五谷雜糧磨粉機 廣州金本機械設備有限公司。

1.2 實驗方法

本條第二款規定，具有高等院校專科以上學歷的公民，可以參加評估師資格全國統一考試。根據這一規定，在學歷方面，只要具有高等院校專科以上學歷的公民，就可以參加評估師資格全國統一考試。資產評估是評定、估算資產價值的專業服務，既需要專業知識，更需要實踐經驗，因此，參加評估師資格考試在學歷方面的要求不宜定得過高，規定具備高等院校專科以上學歷的公民就可以參加考試，有利于通過評估師資格考試吸引和鎖定更多人才。需要注意的是，除房地產估價師考試外，評估師資格全國統一考試是水平評價性質，不是行業準入考試，公民可以自愿參加。有關部門現有的規定與本法規定不一致的，應當在本法實施前及時根據本法作出修改。

1.2.1 芡實種子的預處理 干燥后的芡實種子手工去殼后,將種殼和種仁分離,將種仁用粉碎機粉碎(過100目篩)后,裝入塑料自封袋內,在-18 ℃下儲存,備用。

1.2.2 芡實種仁主要組分分析 水分含量的測定,參照GB 5009.3-2010[17],采用直接干燥法進行測定。蛋白質含量的測定,參照GB 50095-2010[18],采用凱氏定氮法進行測定。淀粉含量的測定,參照GB/T 5009.9-2008[19]進行分析測定。總灰分含量的測定,參照GB 5009.4-2010[20]進行分析測定。

1.2.3 芡實種仁中蛋白質的分離提取 稱取20 g芡實粉,加入200 mL蒸餾水,在40 ℃水浴下磁力攪拌30 min后離心(4000 r/min,10 min),取上清液,沉淀重復提取一次,合并上清液,經透析、冷凍干燥后得到水溶性蛋白樣品。

提取水溶性蛋白后的殘渣再依次用200 mL的70%～75%乙醇溶液和0.1 mol/L NaOH溶液重復上述操作,所得提取液依次為醇溶蛋白和堿溶蛋白樣品[21-22]。

1.2.4 SDS-PAGE電泳分析

1.2.4.1 溶液配制 分別配制電泳用樣品溶解液、電泳緩沖液、染色液以及丙烯酰胺溶液等試劑,備用[23-25]。

1.2.4.2 蛋白質樣品制備 a.芡實總蛋白:取10 mg芡實粉,加入1 mL樣品溶解液,振蕩30 min后,沸水浴5 min,取出冷卻至室溫,高速離心(15000 r/min,15 min),取上清液備用。

b.其他蛋白質:分別取1 mg芡實水溶、醇溶和堿溶蛋白樣品于5 mL離心管中,分別加入1 mL樣品溶解液,振蕩30 min后,沸水浴5 min,取出冷卻至室溫,高速離心(15000 r/min,15 min),取上清液備用。

表1 不同芡實樣品主要營養成分分析Table 1 Analysis of main nutritional components in different varieties of Euryale ferox seed kernels

注:同一行數據中,標有不同小寫字母的數據間在α=0.05顯著水平存在顯著性差異,標有相同字母表示無顯著性差異。

表2 不同芡實樣品總蛋白質亞基分子量分布Table 2 The molecular weight distribution of total protein subunits in different varieties of the Euryale ferox seed kernels

c.電泳分析:制備分離膠以及濃縮膠,然后將制備好的蛋白質樣品溶液加入泳道,調節合適參數對樣品進行電泳分析,得蛋白質樣品電泳凝膠[23-25]。

1.2.5 芡實蛋白氨基酸組成分析 參照GB/T 5009.124-2003[26]方法,采用L-8900氨基酸分析儀對芡實蛋白樣品中的氨基酸組成進行分析。

1.3 數據處理

所有樣品均重復測定3次,結果以平均值±標準差(X±SD)表示,并采用SPSS分析軟件進行數據處理和結果分析。

2 結果與分析

2.1 不同芡實樣品營養組分分析

不同芡實樣品中蛋白質含量如表1所示。結果顯示,5個樣品中,2種成熟樣品的蛋白質含量均高于其他3種生長期芡實,最高的是刺芡(成熟),達13.72%,最低的是蘇芡(嫩),除了刺芡(嫩)與淮芡(嫩)差異不顯著(p>0.05)外,其他樣品間蛋白質含量差異顯著(p≤0.05)。說明成熟種子中蛋白質組分累計完全,而生長期種子中淀粉、蛋白質等大分子的累計過程還未結束。

不同芡實樣品中的淀粉含量變化與蛋白質結果基本一致。總灰分含量以2種成熟芡實種仁中含量較高,品種間差異顯著(p≤0.05),生長期種子中刺芡(嫩)最高,顯著高于蘇芡(嫩)和淮芡(嫩)。因此,芡實種子的具體收獲時間要根據種子的用途來安排,一般留種或以干制芡實米加工的應在入冬后收獲,以保證種仁中各種營養組分的充分積累。而芡實嫩米加工時要準確把握采收期,果實發育期不能超過兩周,否則會因淀粉含量過高而影響產品口感[27]。

2.2 不同芡實樣品蛋白質組成分析

2.2.1 芡實種仁總蛋白質 不同芡實樣品中總蛋白質的SDS-PAGE圖譜及分子量分布如圖1和表2所示。結果顯示,不同芡實樣品總蛋白質的亞基數量和相對分子量分布都非常接近,沒有發現差異性譜帶。在本實驗條件下,共分離出12～20條譜帶,其中比較清楚的12條譜帶對應的相對分子量列在表2中。芡實種仁總蛋白質的相對分子質量在16.24～82.04 kDa之間。其中相對分子質量在35.9 kDa左右的7號亞基含量最高,從條帶形狀和顏色可以看出,該亞基的含量在芡實總蛋白中所占的比例最大(約85%)。

圖1 不同芡實樣品總蛋白質的SDS-PAGE圖譜Fig.1 SDS-PAGE graph of total proteins from different varieties of Euryale ferox seed kernels注:圖中頂部1～5依次為:刺芡(成熟)、蘇芡(成熟)、刺芡(嫩)、蘇芡(嫩)和淮芡(嫩)。圖中右側縱列1～12為亞基編號。圖2～圖4同。

圖2 不同芡實樣品水溶蛋白的SDS-PAGE圖譜Fig.2 SDS-PAGE graph of water soluble proteins from different varieties of Euryale ferox seed kernels

2.2.2 芡實種仁水溶性蛋白質 不同芡實樣品中水溶蛋白的SDS-PAGE圖譜見圖2。在本實驗條件下,芡實種仁水溶性蛋白質共分離出兩條譜帶:29.68 kDa和37.90 kDa,且譜帶顏色很淺。說明芡實種仁中水溶性蛋白質含量很少,而且不同品種間、不同成熟度芡實種仁間的差異很大。首先,芡實種仁水溶性蛋白質存在品種間差異:雖然成熟的刺芡和蘇芡中都含有這2條亞基,但是刺芡(成熟)中的37.90 kDa亞基含量明顯低于蘇芡(成熟),而29.68 kDa亞基差異不明顯。其次,刺芡(嫩)中只有37.90 kDa亞基,說明29.68 kDa亞基可能是芡實種子后期合成的,也可能是種子在后期成熟中某一高分子量亞基分解產生。而蘇芡(嫩)和淮芡(嫩)不含有水溶性蛋白,這2種芡實同屬于南芡。該結果表明,南芡種仁中水溶性蛋白的合成可能較晚,可能在種子成熟后期,甚至在種子采收后的貯藏期間。

表3 不同芡實樣品中氨基酸的組成(g/100 g)Table 3 The amino acid compositions of different samples of Euryale foerx seed kernels(g/100 g)

注:*表示必需氨基酸;各種風味氨基酸的計算如下:苦味氨基酸:Leu、Ile、Val、Phe、Tyr、Ser、His、Lys和Arg,共9種;甜味氨基酸:Gly、Ala、Thr和Pro,共4種;鮮味氨基酸:Glu、Asp、Ala、Gly、Phe和Tyr,共6種。

2.2.3 芡實種仁醇溶性蛋白質 不同芡實樣品醇溶性蛋白質的電泳圖譜如圖3所示。結果顯示,樣品1～4中均檢出亞基一個,分子量在38.44 kDa左右,而淮芡(嫩)中未檢出醇溶性蛋白質。該結果可能有兩種解釋,淮芡(嫩)中不含有該醇溶性亞基,也有可能是淮芡(嫩)中該醇溶性亞基尚未合成或已經分解,具體的原因還需根據對不同生長期芡實種子的分析來驗證。

圖3 不同芡實樣品醇溶蛋白SDS-PAGE圖譜Fig.3 SDS-PAGE graph of gliadinsfrom different varieties of Euryale ferox seed kernels

2.2.4 芡實種仁堿溶性蛋白質 不同芡實樣品中堿溶性蛋白質電泳圖譜如圖4所示。結果顯示,堿溶性蛋白質亞基及分子量分布的品種間和成熟度間差異不大。所有樣品中均檢出2條譜帶,分子量為37.97 kDa和21.84 kDa。

圖4 不同芡實樣品中堿溶蛋白SDS-PAGE圖譜Fig.4 SDS-PAGE graph of alkali soluble proteins from different varieties of Euryale ferox seed kernels

2.3 不同芡實樣品中蛋白質的氨基酸組成

不同芡實樣品中蛋白質的氨基酸組成分析如表3所示。結果顯示,在所測定的17種氨基酸中,除脯氨酸外,刺芡(成熟)樣品中的各氨基酸含量最高,氨基酸的總含量也最高(8.94 g/100 g),其次是刺芡(嫩),氨基酸總含量最低的是蘇芡(嫩),只有7.33 g/100 g,成熟芡實品種氨基酸總量均高于生長期芡實品種,主要原因是其成熟度不夠。從風味氨基酸分析結果看,刺芡樣品中的甜味氨基酸、鮮味氨基酸和苦味氨基酸含量均高于蘇芡。由此說明,芡實種仁經烹飪或加工后,刺芡種仁的風味比蘇芡濃些,其主要原因可能是加工中蛋白質發生部分水解,刺芡種仁產生了更豐富的風味氨基酸。此外,有文獻報道蘇芡的口感比刺芡糯性大,口感好。這是因為蘇芡種仁中的支鏈淀粉含量(48.30%)高于刺芡(38.82%)[27]。從本實驗中氨基酸營養效價來看,刺芡要稍優于蘇芡。

3 結論

本實驗選擇3個不同品種、2種不同成熟度的5個芡實種仁樣品,對其中的蛋白質亞基結構和氨基酸組成進行了初步分析。結果表明,不同品種的成熟芡實中蛋白質含量差異顯著(p≤0.05),刺芡(成熟)顯著高于蘇芡(成熟)。采用SDS-PAGE法從芡實種仁總蛋白中分離出約20條譜帶,不同品種、不同成熟期芡實種仁間無差異性譜帶出現。其中分子量35.9 kDa左右的亞基含量最高,是芡實蛋白中最主要的亞基。芡實種仁中水溶性蛋白質含量很少,且不同成熟度芡實種仁間的差異很大。蘇芡(嫩)和淮芡(嫩)中未檢出水溶性蛋白。不同品種芡實種仁中醇溶性蛋白質亞基組成差異較大,可以作為芡實品種間差異性深入分析的依據。

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The subunit distributions and amino acids analysis of the proteins from different varieties ofEuryaleferoxseed kernels

CHEN Jing1,2,CHEN Zhi-hong2,ZHANG Cuan2,*,BAI Yu2,WANG Mei2

(1.Department of Food and Environmental Engineering,Chuzhou Vocational and Technical College,Chuzhou 239000,China; 2.Heat Sensitive Materials Processing Engineering Technology Research Center,Chuzhou 239000,China)

Five kinds of different varieties and maturityEuryaleferoxseeds samples were selected and their protein subunit structures and amino acid compositions were analyzed in the article. The results showed that the protein content of northernEuryaleferox(mature)seeds was higher markedly than southernEuryaleferox(mature)seeds(p≤0.05),furthermore the essential amino acids、sweet amino acids and umami amino acids contents in northernEuryaleferox(mature)seed proteins were also higher than southernEuryaleferox(mature)seeds,which illustrated that the northernEuryaleferoxwas better than the southernEuryaleferoxin terms of(nutrition and taste. It was resulted that in the SDS-PAGE analysis,twenty bands were separated from the totalEuryaleferoxseeds protein with relative molecular mass between 16.24～82.04 kDa. In addition,the subunit with relative molecular mass at about 35.9 kDa had highest content which was the major subunit in totalEuryaleferoxseeds protein. The contents of water soluble protein were few inEuryaleferoxseeds and there were great differences between different maturites. No water soluble protein was detected in theEuryaleferoxseeds from southernEuryaleferox(not mature)and HuainanEuryaleferox(not mature). The alcohol soluble protein subunit compositions had great diversities among different varieties but no much difference was found in the subunits and molecular weight distribution of alkali-soluble protein from different breeds and ripeness.

Euryaleferoxseed kernel protein;subunit distribution;SDS-PAGE;amino acid analysis

2016-09-19

陳靜(1987-)，女，碩士，助教，研究方向：食品分析檢測,E-mail：bingxuefeiyan2008@126.com。

*通訊作者:張汆(1970-)，女，博士，教授，研究方向：食品化學與營養學、功能食品研究,E-mail:zhangchuan2005@126.com。

公益性行業(農業)科研專項(201403039)；安徽省熱敏性物料加工工程技術研究中心開放基金課題(2015RMY03)；安徽省高校自科重點項目(KJ2016A537)；滁州學院科研項目(2014GH36)。

TS201

A

1002-0306(2017)08-0098-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.08.011