蜜柚葉黃酮的提取及其抗氧化與降尿酸活性研究

鄭亞美,任嬌艷,史傳超

(華南理工大學食品科學與工程學院,廣東廣州 510640)

蜜柚葉黃酮的提取及其抗氧化與降尿酸活性研究

鄭亞美,任嬌艷*,史傳超

(華南理工大學食品科學與工程學院,廣東廣州 510640)

研究蜜柚葉總黃酮的提取工藝、抗氧化活性及其對黃嘌呤氧化酶的抑制活性。采用正交實驗對蜜柚葉黃酮的提取工藝進行優(yōu)化,探究蜜柚葉黃酮的最佳提取工藝條件。并通過DPPH自由基、羥自由基及超氧陰離子清除實驗探究蜜柚葉黃酮對自由基離子的清除活性;通過黃嘌呤氧化酶活性抑制實驗初步判斷其降尿酸功效。結(jié)果表明:蜜柚葉黃酮的最佳提取條件為料液比1∶30(g/mL)、乙醇濃度80%、浸提時間6 h、浸提溫度80 ℃,黃酮得率為12.41 mg/g。蜜柚葉黃酮對DPPH自由基、羥自由基及超氧陰離子均表現(xiàn)出較強的清除活性,IC50值分別為:1.47、1.04、1.49 mg/mL。同時,蜜柚葉黃酮對黃嘌呤氧化酶抑制活性的IC50值為4.8 mg/mL。

蜜柚葉,黃酮,抗氧化,降尿酸活性

人體新陳代謝會產(chǎn)生大量的自由基,由自由基導致的氧化損傷與許多疾病的發(fā)生與發(fā)展有密切的關系,如動脈粥樣硬化、血栓的形成、糖尿病及致癌、促癌及癌的形成過程中均有自由基的產(chǎn)生與參與[1]。因此,易于人體吸收且能清除人體內(nèi)自由基的天然抗氧化劑-黃酮類化合物已成為現(xiàn)階段研究的熱點。黃酮類化合物是廣泛存在于植物皮、根、葉、果實中的一類天然有機化合物,具有廣泛的生物活性,如抗氧化、抗腫瘤、抑菌、調(diào)節(jié)免疫、抗炎、抗過敏、止血鎮(zhèn)痛等,已被列為保健食品的一類功能因子[2]。流行病學研究還表明,長期攝入富含黃酮類化合物的食物能顯著地降低腫瘤、心腦血管疾病等慢性病的發(fā)生機率[3]。

我國柚子栽培面積大,種植歷史悠久。目前,人們對柚子的研究主要集中于柚子果皮及果肉的研究,對柚子葉的研究鮮有報道。柚子葉似柑、橘葉,呈橢圓形或長卵圓形,翼葉為心臟型,是典型的單復葉。為探究柚子葉功能性成分,本實驗采用正交實驗方法優(yōu)化柚子葉黃酮的提取工藝,并通過DPPH自由基、羥自由基及超氧陰離子清除活性實驗探究柚子葉黃酮的抗氧化活性,通過測定柚子葉黃酮對黃嘌呤氧化酶的抑制活性初步評價其降尿酸功效,以期為柚子葉黃酮的綜合開發(fā)利用提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蜜柚采摘之后成熟期蜜柚葉 廣東梅州;蘆丁 分析純,國藥集團化學試劑有限公司;亞硝酸鈉(分析純)、無水乙醇 廣東光華科技股份有限公司;硝酸鋁、結(jié)晶氯化鋁、鹽酸 廣州化學試劑廠;氫氧化鈉 天津啟輪化學科技有限公司;氯化硝基四氮唑藍(NBT),1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH·)、黃嘌呤、黃嘌呤氧化酶 Sigma公司。

RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠;UV754N紫外分光光度計 上海儀電分析儀器有限公司;THZ-82A水浴恒溫振蕩器 常州澳華儀器有限公司;Synergy NEO HTS多功能微孔板檢測儀 美國伯騰儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 工藝流程 將洗凈的蜜柚葉于太陽下常溫曬干后置于80 ℃烘箱烘20 min徹底烘干,將烘干的蜜柚葉去梗、粉碎并過60目篩后裝入封口袋中備用。實驗過程中,準確稱取10.0 g蜜柚葉粉末于一定體積分數(shù)的乙醇溶液中,恒溫振蕩浸提一段時間后用三層紗布過濾,將濾液于4000×g條件下25 ℃高速離心20 min,收集并濃縮(45 ℃恒溫旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮)濾液至體積為50 mL。設計單因素實驗研究料液比、乙醇濃度、浸提時間、浸提溫度對蜜柚葉黃酮浸提效果的影響。

1.2.2 單因素實驗

1.2.2.1 料液比對蜜柚葉黃酮提取效果(總黃酮得率)的影響 準確稱取10.0 g蜜柚葉粉末于錐形瓶,分別按料液比為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50的比例依次加入80%的乙醇溶液,在70 ℃的搖床中恒溫浸提6 h,探索料液比對蜜柚葉黃酮提取效果的影響。

1.2.2.2 浸提時間對蜜柚葉黃酮浸提效果的影響 準確稱取10.0 g蜜柚葉粉末于錐形瓶,各加入80%的乙醇溶液60 mL,并置于80 ℃ 的搖床中恒溫提取2、4、6、8、10 h,研究浸提時間對蜜柚葉黃酮浸提效果的影響。

1.2.2.3 浸提溫度對蜜柚葉黃酮浸提效果的影響 準確稱取10.0 g蜜柚葉粉末于錐形瓶,各加入80%的乙醇溶液60 mL,并分別置于40、50、60、70、80 ℃溫度下的搖床中恒溫浸提6 h,探索溫度對蜜柚葉黃酮浸提效果的影響。

1.2.2.4 乙醇體積分數(shù)對蜜柚葉黃酮浸提效果的影響 準確稱取10.0 g蜜柚葉粉末于錐形瓶,分別加入體積分數(shù)為50%、60%、70%、80%、90%的乙醇溶液60 mL,并置于80 ℃的搖床中恒溫浸提6 h,研究乙醇體積分數(shù)對蜜柚葉黃酮浸提效果的影響。

1.2.3 提取工藝的正交實驗優(yōu)化 在單因素實驗基礎上,用Design-Expert 8.0設計正交實驗,確定柚子葉黃酮提取的最佳工藝條件。實驗以料液比、乙醇體積分數(shù)、浸提溫度及浸提時間作為4個考察因素,選取3個水平,并設計L9(34)正交實驗。

表1 蜜柚葉黃酮提取工藝正交實驗因素水平表Table 1 Factors and levels table of orthogonal experiment

1.2.4 測定方法

1.2.4.1 總黃酮含量的測定 測定方法參考文獻[4]。取6個10 mL試管,向其中加入0、0.6、1.2、1.8、2.4、3 mL濃度為0.2 g/mL的蘆丁標準液,然后加去離子水至體積為3 mL,混勻后加入150 μL質(zhì)量分數(shù)為5%的NaNO2溶液,振蕩混勻,靜置6 min后加入300 μL 質(zhì)量分數(shù)為10%的AlCl3·6H2O溶液,振蕩混勻,靜置5 min后加入1.0 mL濃度為1 mol/L的NaOH溶液,最后加入550 μL去離子水至反應液總體積為5.0 mL,振蕩均勻,并于510 nm波長處測定吸光值。線性回歸方程為y=0.0011x-0.0002(R2=0.9999),式中，x為蘆丁溶液質(zhì)量濃度(mg/mL),y為A510 nm。吸取蜜柚葉浸提液10 μL,按標準曲線的步驟測吸光度,并將結(jié)果按x=(y+0.0002)/0.0011計算得浸提液中黃酮濃度。

提取得率(mg/g)=測定濃度×稀釋倍數(shù)×提取液體積/提取所用粉末質(zhì)量

1.2.4.2 蜜柚葉黃酮抗氧化活性測定 將蜜柚葉浸提液配制成0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/mL五個濃度梯度溶液備用。

a. DPPH·的清除活性 測定方法參照文獻[5]。用無水乙醇將DPPH·試劑溶解定容,配制成濃度為0.1 mmol/L的DPPH·儲備液,置于冰箱中冷藏備用。精密量取蜜柚葉黃酮溶液1 mL及DPPH·醇溶液2 mL混勻,室溫下反應30 min后在517 nm處測定吸光度。DPPH·清除率(%)=[1-(As-Ac0)/Ac1]×100，式中As代表樣品吸光度,Ac0代表樣品溶液空白對照吸光度,Ac1代表DPPH·醇溶液吸光度。

b.對羥自由基清除能力的測定 參照文獻[6]采用鄰二氮菲法測定羥自由基清除能力。樣品管:將1.2 mL濃度為5 mmol/L的鄰二氮菲與0.8 mL pH=7.4的PBS充分混勻后,加入1.2 mL一定濃度梯度的蜜柚葉黃酮溶液,混勻之后分別加入1.2 mL濃度為15 mmol/L的EDTA、1.2 mL濃度為15 mmol/L的FeSO4及1.6 mL體積濃度為0.1%的H2O2,37 ℃保溫1 h后在536 nm處測定混合溶液的吸光值記為A樣品。

損傷管:以1.2 mL的PBS溶液代替樣品溶液,其他均與樣品管相同,536 nm處測定混合溶液的吸光值記為A損傷。

未損傷管:以1.6 mL的PBS溶液代替H2O2溶液,其他均與樣品管相同,536 nm處測定混合溶液的吸光值記為A未損傷。

羥自由基清除率(%)=(A樣品-A損傷)/(A未損傷-A損傷)×100

c.對超氧陰離子清除活性的測定 測定方法參照文獻[7]。于96孔板微孔中分別加入20 μL 3 mmol/L的黃嘌呤溶液后再加入0.6 mmol/L NBT溶液180 μL,振蕩搖勻后加入20 μL蜜柚葉浸提液,搖勻后于37 ℃反應5 min,然后向混合溶液中加入20 μL濃度為0.1 u/mL的黃嘌呤氧化酶溶液,將96孔板于37 ℃恒溫保溫30 min后于560 nm處測定吸光值,記為Asample。

以磷酸鹽緩沖液代替樣品溶液作為空白對照,560 nm處測定吸光值,記為Acontrol。

清除率(%)=(Acontrol-Asample)/Acontrol×100

為綜合評價蜜柚葉黃酮對自由基離子的清除活性,實驗以不同濃度的VC及沒食子酸溶液為對照品,并以同樣的實驗方法測定其對各自由基離子的清除活性。

1.2.4.3 蜜柚葉黃酮對黃嘌呤氧化酶的抑制活性測定 測定方法參照文獻[8]。于96孔板中每孔加入50 μL待測樣品液及50 μL 濃度為0.005 μ/mL的黃嘌呤氧化酶液(XO),于酶標儀中振蕩30 s后,25 ℃保溫5 min。然后加入150 μL 濃度為0.4276 mmol/L的黃嘌呤溶液(Xanthine),振蕩30 s后,25 ℃保溫25 min,在290 nm波長處檢測,空白實驗以pH=7.4的PBS溶液代替樣品液,每個樣品扣除顏色實驗是以pbs代替黃嘌呤氧化酶溶液。每組樣品設置三個平行。以不同濃度的別嘌呤醇做陽性對照。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實驗重復三次,實驗結(jié)果采用平均值±標準差(mean±SD)的形式表示。使用Origin 8.5軟件和SPSS 19.0 軟件對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析(One-Way ANOVA),并利用 Origin 8.5 軟件進行繪圖。

2 結(jié)果分析

2.1 各單因素對蜜柚葉總黃酮浸提效果的影響

2.1.1 料液比對蜜柚葉總黃酮提取效果的影響 如圖1所示,料液比對總黃酮提取效率影響顯著,當液料比小于1∶40時,隨著液料比的增加,總黃酮得率顯著增加,這可能是因為溶劑量的增加提高了柚子葉與溶劑間黃酮類化合物的濃度差,從而減少了柚子葉中黃酮類物質(zhì)的殘留量[9]。當液料比大于1∶40時,增加料液比,總黃酮得率變化不明顯,這一結(jié)果說明當料液比為1∶40時,柚子葉原料中的總黃酮已基本完全溶出。所以選擇料液比為1∶20、1∶30及1∶40為正交實驗研究水平。

圖1 料液比對蜜柚葉總黃酮得率的影響Fig.1 Effect of ratio of material to solvent on extraction efficiency of flavonoids from Honey pomelo leaves

圖2 浸提時間對蜜柚葉總黃酮得率的影響Fig.2 Effect of extraction time on extraction efficiency of flavonoids from Honey pomelo leaves

2.1.2 浸提時間對蜜柚葉黃酮浸提效果的影響 如圖2所示,隨著浸提時間的增加蜜柚葉總黃酮的提取率呈先增加后基本不變的趨勢,這一結(jié)果說明,當恒溫浸提時間達到6 h左右,柚子葉原料中的黃酮類物質(zhì)已基本完全溶出,此時蜜柚葉黃酮的提取得率為11.67 mg/g,繼續(xù)增加浸提時間,黃酮類化合物的得率不再增加[10]。所以選擇浸提時間為4、6及8 h為正交實驗研究水平。

2.1.3 浸提溫度對蜜柚葉黃酮浸提效果的影響 浸提溫度對蜜柚葉總黃酮提取效果的影響結(jié)果如圖3所示,隨著浸提溫度的增加,總黃酮得率總體呈上升趨勢,這是因為溫度升高,溶劑粘度減小,浸提液及溶質(zhì)擴散系數(shù)增大,分子運動更加激烈,從而使得有效成分的溶解和滲透速度加快,黃酮的溶出速度隨之增大,得率提高[11-12]。但由圖可知,當溫度高于70 ℃時,總黃酮得率增加不明顯,且有下降趨勢,這可能是因為溫度過高,導致部分黃酮類物質(zhì)分解的結(jié)果[13]。所以選擇浸提溫度為60、70及80 ℃為正交實驗研究水平。

圖3 浸提溫度對蜜柚葉總黃酮得率的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on extraction efficiency of flavonoids from Honey pomelo leaves

2.1.4 乙醇體積分數(shù)對蜜柚葉黃酮浸提效果的影響 乙醇體積分數(shù)對蜜柚葉總黃酮提取效果的影響結(jié)果如圖4所示,隨著乙醇體積分數(shù)的增加,總黃酮得率呈現(xiàn)出顯著的先增加后降低的趨勢,且在乙醇體積分數(shù)為70%左右時,總得率達到最佳。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能是因為黃酮類物質(zhì)在醇類溶劑中的溶解度大于在水中的溶解度[14]。當浸提體系為乙醇-水體系時,乙醇體積分數(shù)越大,黃酮類物質(zhì)的浸出率就越大[15]。但當乙醇體積分數(shù)達到一定值,繼續(xù)增加乙醇體積分數(shù),其他醇溶性雜質(zhì)的浸出效率也隨之增加,此時,雜質(zhì)與目標物質(zhì)的競爭力增大,從而使黃酮類物質(zhì)的提取率下降[16-17]。所以選擇乙醇體積分數(shù)為60%、70%及80%為正交實驗研究水平。

圖4 乙醇體積分數(shù)對蜜柚葉總黃酮得率的影響Fig.4 Effect of ethanol concentration on extraction efficiency of flavonoids from Honey pomelo leaves

2.1.5 正交實驗探究 根據(jù)單因素實驗結(jié)果,選取料液比(A)、浸提時間(B)、浸提溫度(C)、乙醇體積分數(shù)(D)四個因素按照L9(34)正交表對蜜柚葉黃酮提取工藝進行優(yōu)化。實驗結(jié)果如表2所示。

表2 正交實驗設計及結(jié)果Table 2 Orthogonal array design and results

由正交實驗結(jié)果可知,四個實驗因素對蜜柚葉總黃酮提取得率的影響依次為:浸提溫度(C)>乙醇體積分數(shù)(D)>浸提時間(B)>料液比(A)。蜜柚葉黃酮提取最佳工藝條件為:A2B2C3D3，即料液比為 1∶30、浸提時間 6 h、浸提溫度80 ℃、乙醇體積分數(shù) 80%。在以上優(yōu)化后工藝條件下進行驗證實驗,蜜柚葉黃酮得率為12.41 mg/g。

2.2 蜜柚葉黃酮的抗氧化活性及其對黃嘌呤氧化酶的抑制活性

2.2.1 蜜柚葉黃酮對DPPH·、羥自由基及超氧陰離子的清除活性 DPPH·是一種很穩(wěn)定的以氮為中心的自由基,其分子中3個苯環(huán)的共振穩(wěn)定作用及空間障礙使位于分子中間的氮原子上不成對的電子不能發(fā)揮其應有的電子成對作用,從而能夠捕獲(清除)其他自由基[18]。DPPH·的清除反應是一類基于電子轉(zhuǎn)移的反應。圖5表示蜜柚葉黃酮對DPPH·的清除活性,VC、沒食子酸及蜜柚葉黃酮對DPPH·的清除活性均隨濃度的增加而升高。其中,在相同濃度下,VC對DPPH自由基的清除活性均高于沒食子酸,當蜜柚葉黃酮濃度為2.5 mg/mL時,其對DPPH自由基的清除率為57%。VC、沒食子酸及蜜柚葉黃酮對DPPH·清除活性的IC50值分別為47.94 μg/mL、77.71 μg/mL、1.47 mg/mL。

圖5 蜜柚葉黃酮對DPPH·的清除作用Fig.5 DPPH· radical scavenging activities of flavonoids from Honey pomelo leaves

羥自由基是人體內(nèi)最活潑的自由基,它能夠殺死紅細胞,使DNA、多糖及細胞膜等物質(zhì)降解,但當加入自由基清除劑以后,由它所致的有害效應會明顯降低[19]。蜜柚葉黃酮對·OH的清除活性結(jié)果如圖6所示,VC、沒食子酸及蜜柚葉黃酮對·OH的清除活性均呈一定的計量效應關系,濃度越高,對·OH的清除活性越強。當蜜柚葉黃酮的濃度為2.5 mg/mL時,其對·OH的清除率為97%。VC、沒食子酸及蜜柚葉黃酮對·OH清除活性的IC50值分別為0.36、0.54、1.04 mg/mL。

圖6 蜜柚葉黃酮對羥自由基的清除作用Fig.6 ·OH radical scavenging activities of flavonoids from Honey pomelo leaves

超氧陰離子與人體內(nèi)-OH結(jié)合后的產(chǎn)物會導致細胞DNA的損傷,從而破壞人體機能[20]。蜜柚葉黃酮對超氧陰離子的清除活性結(jié)果如圖7所示,相同濃度下,沒食子酸對超氧陰離子的清除活性高于VC。當沒食子酸濃度為0.8 mg/mL時其對超氧陰離子的清除率達到99%。當VC濃度為1.0 mg/mL時對超氧陰離子的清除率達到97%。蜜柚葉黃酮對超氧陰離子的清除活性隨濃度的增加而增強,當蜜柚葉黃酮濃度為2.5 mg/mL時其對超氧陰離子的清除活性為79%。沒食子酸、VC及蜜柚葉黃酮對超氧陰離子清除活性的IC50值分別為:0.43、0.57、1.49 mg/mL。

圖7 蜜柚黃酮對超氧陰離子的清除活性flavonoids from Honey pomelo leaves

2.2.2 蜜柚葉黃酮對黃嘌呤氧化酶的抑制活性 蜜柚葉黃酮對黃嘌呤氧化酶的抑制活性結(jié)果如圖7所示,總體上,蜜柚葉黃酮對黃嘌呤氧化酶的抑制活性與別嘌呤醇抑制黃嘌呤氧化酶活性趨勢一致,均呈一定的劑量效應關系,即隨著濃度的增加,抑制活性增強。別嘌呤醇及蜜柚葉黃酮對黃嘌呤氧化酶抑制活性的IC50值分別為8.7 μg/mL、4.8 mg/mL。張雪等[21]研究了大血藤、鎖陽、吳茱萸、木瓜、老鶴草五種中草藥水提及醇提物對黃嘌呤氧化酶的抑制作用,除老鶴草水提及醇提物對黃嘌呤氧化酶抑制活性的IC50值小于4.8 mg/mL以外,其余4種中草藥的水提及醇提物抑制黃嘌呤氧化酶的IC50值均大于4.8 mg/mL,說明蜜柚葉黃酮對黃嘌呤氧化酶的抑制活性較一般中草藥都要強。

圖8 蜜柚黃酮對黃嘌呤氧化酶的抑制活性Fig.8 Effect of xanthine oxidase activity of flavonoids from sweet pomelo leaves

3 結(jié)論

通過工藝優(yōu)化,確定提取蜜柚葉黃酮的最佳工藝條件為:料液比為 1∶30、浸提時間 6 h、浸提溫度80 ℃、乙醇體積分數(shù)80%。此條件下,黃酮得率可以達到12.41 mg/g。同時蜜柚葉黃酮對DPPH自由基、羥自由基及超氧陰離子清除活性的IC50值分別為1.47、1.04、1.49 mg/mL。與大血藤、鎖陽、吳茱萸、木瓜等中草藥相比,蜜柚葉黃酮表現(xiàn)出較強的黃嘌呤氧化酶抑制活性。蜜柚葉黃酮的分離純化、結(jié)構(gòu)鑒定及對黃嘌呤氧化酶抑制機理還有待進一步研究,本實驗首次研究蜜柚葉黃酮的抗氧化活性及其對黃嘌呤氧化酶的抑制活性,旨在為蜜柚葉的綜合開發(fā)利用提供一定的理論依據(jù)。

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Extraction of flavonoids fromHoneypomeloleaves and study on its antioxidant and uric acid reduction activities

ZHENG Ya-mei,REN Jiao-yan*,SHI Chuan-chao

(School of Food Science and Engineering,South China University of Technology,Guangzhou 510640,China)

In order to investigate the extraction processes of flavonoids fromHoneypomeloleaves and its antioxidant and uric acid reduction activities,the extraction conditions of flavonoids were optimized primarily by orthogonal array design. In addition,the DPPH·,hydroxyl free radical and superoxide anion free radical scavenging activities were determined to evaluate the antioxidant activity of the flavonoids and the inhibition of xanthine oxidase activity was determined to preliminary judging its uric acid reduction activity. Results indicated that optimal extraction processing parameters were the ratio of material to solvent of 1∶30(g/mL),ethanol concentration of 80%,extraction temperature of 80 ℃,extraction time of 6 h,the extraction efficiency of flavonoids fromHoneypomeloleaves was 12.41 mg/g. Meanwhile,in DPPH radical,hydroxyl radical and superoxide anion scavenging assays,the IC50of the scavenging activities of flavonoids fromHoneypomeloleaves were 1.47,1.04 mg/mL and 1.49 mg/mL. The inhibition of xanthine oxidase assay illustrated that the flavonoids showed a certain degree of suppression effect of xanthine oxidase(IC50:4.8 mg/mL).

Honeypomeloleaves;flavonoids;antioxidant activity;uric acid reduction activity

2016-10-04

鄭亞美 (1991-)，女，碩士研究生，研究方向：食品生物化學、食品營養(yǎng)與健康,E-mail:zheng386007@163.com。

*通訊作者:任嬌艷(1980-)，女，教授，研究方向：食品生物化學、食品營養(yǎng)與健康，E-mail:jyren@scut.edu.cn。

廣東省自然科學杰出青年基金項目(S2013050013954)；“廣東特支計劃”科技青年拔尖人才項目(2014TQ01N645)；2016年廣東省攀登計劃項目(pdjh2016b0049)。

TS201.1

B

1002-0306(2017)08-0262-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.08.042